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1、保健食品抗氧化功能的斑马鱼检测1范围本标准规定了一种保健食品抗氧化功能的快速检测方法。本标准适用于保健食品产品、配方和原料抗氧化功能的快速检测和筛查。有以下特征的受试物不适用于本标准的方法：受试物不能溶解、乳化或制备成均匀分散的悬浮液；受试物溶液颜色较深或不溶性颗粒，对测试的干扰无法消除；受试物会产生自体荧光，对测试的干扰无法消除。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡 是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 21808化学品鱼类延长毒性14天试验GB 14924.2实验动物配合饲料卫生标
2、准SN/T 0476进出口卤虫卵检验方法NY 5073无公害食品水产品中有毒有害物质限量NY 5072无公害食品渔用配合饲料安全限量GB 5749生活饮用水卫生标准3术语及定义3.1 无可观察效应浓度 no observed effect concentration （NOEC）与对照相比，对试验生物未产生显著效应的最高受试物浓度。来源：GB/T 21808，2.5。3.2亲鱼指用来繁殖测试所需鱼卵的成年斑马鱼。3.3 活性氧簇 reactive oxygen species （ROS）是含氧的化学物质，包括：O2-、H2O2及HO2、-OH等，是体内氧化反应的物质基础，也是体内过氧化效 应产
3、生的根源，与人体衰老、慢性炎症、癌症等疾病的发生、发展、预防和治疗密切相关。4方法原理体内的ROS水平高低是由体内活性氧产生与消除的平衡状态所决定。体内ROS水平上升时，会消耗体内抗 氧化物质，如果体内抗氧化物质的合成速度慢且抗氧化酶对ROS的清除速度不够快时，就会导致脂质和蛋白的 过氧化水平升高，引起衰老等跟过氧化相关的生理现象。如果受试物能够加快体内抗氧化物质的合成速度、提 升抗氧化酶的活力，就能迅速消除体内产生的ROS,从而降低ROS诱发的脂质和蛋白过氧化水平，使体内活性 氧产生与消除保持在一个有益于身体健康的的平衡状态。因此，ROS是一个能够更直接地反映体内体内活性氧 产生与消除之间平
4、衡状态的指标。受试物处理后体内ROS水平的降低也能直接反映受试物的抗氧化能力。CM-H2DCFDA （5-（and-6）-chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester）是- -种常用的 ROS特异性荧光检测试剂，将CM-H2DCFDA加入养有斑马鱼的水体之后，CM-H2DCFDA会在斑马鱼体内ROS 的氧化作用下形成高荧光强度的DCF（2,7-di-chlorofluorescein，二氯荧光素），DCF的产生量与体内ROS水平 正相关。通过酶标仪检测DDCF的荧光信号，就可以得到体内ROS的相对水平。将
5、受试物和cm-h2dcfda共同加 入养有斑马鱼的水体一段时间后，如受试物具有抗氧化活性，DCF的产生量减少，荧光信号强度就会减弱。本 方法是对斑马鱼的ROS进行活体检测，不需要取血或将斑马鱼解剖、匀浆，解决了 因ROS自身不稳定造成的检 测结果不可靠的问题。5试剂和材料5.1 CM-HDCFDA试剂（分子式：C7HQCLO，分子量：577.8）： ROS检测试剂。22/ 19 3 85.2 三卡因（Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt，别名MS-222， CAS号：886-86-2）:用于麻醉斑马 鱼。5.3斑马鱼繁殖容器：用于繁殖斑马鱼鱼卵
6、。用聚苯乙烯或其它惰性材料制成的容器，容器中有可移动的网格 或透明板来隔开雄鱼和雌鱼，同时要有聚苯乙烯或其它惰性材料做成的隔栅或丝网来隔离成鱼和鱼卵，网格尺 寸应保证产下的鱼卵可以顺利漏过。5.4斑马鱼孵育容器：用于斑马鱼鱼卵和幼鱼的孵育。用聚苯乙烯或其它惰性材料制成的容器，如24孔细胞培 养板、96孔黑色酶标板、培养皿、培养罐等。5.5液体量取器材及其它易耗品：移液枪、容量瓶、烧杯、铝箔、巴氏吸管等。5.6其它常规试剂：如盐酸、氢氧化钠、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾等，试剂纯度不低于化学纯等级。6仪器和设备6.1斑马鱼养殖设备：设备需配有温控装置，养殖容器用玻璃或聚碳酸酯等惰性材料制成，
7、用于饲养成年斑马 鱼。6.2斑马鱼鱼卵和幼鱼培养设备：带有温控和进风装置，推荐使用生化培养箱。6.3电子天平：精度0.1 mg。6.4水质检测设备：盐度计（电导率测定仪）、硬度计、pH计、溶解氧测定仪。6.5普通体视显微镜：用于在明场下观察斑马鱼个体发育和行为是否正常。6.6多功能酶标仪：用于检测CM-H2DCFDA被ROS氧化后的产物DCF的荧光信号。DCF的最佳激发波长是492-495 nm，最佳发射波长在517-527 nm，多功能酶标仪能够检测的激发波长和发射波长应该尽量接近上述最 佳波长范围，以确保可以检测到DCF的荧光信号7试验准备7.1受试鱼类7.1.1鱼种的选择推荐使用野生型A
8、B品系斑马鱼（Danio rerb，亲鱼应具有较好的繁殖能力一一鱼龄以6-12个月为佳。使 用其它品系的斑马鱼时，要根据实际情况对试验条件做相应调整，并在报告中说明鱼种选择理由和试验方法。 7.1.2亲鱼的驯养在繁殖前，亲鱼应在符合下列条件的环境中驯养14天以上：a）水：详见7.2.1 a ）成鱼养殖用水。b）水温：26-28.5 C。c）光照：推荐光照/黑暗周期为14小时/10小时，每天光照应不少于12小时。d）溶解氧：6 mg/L-饱和溶解氧。e）喂养：每天至少喂食两次，可以搭配喂食活饵饲料（卤虫幼虫）和热带鱼配合饲料，每天至少喂食一次 活饵饲料。用于孵化卤虫幼虫的卤虫卵应按SN/T 04
9、76的规定进行检验，有毒有害物质的含量应符合NY 5073 的规定执行。配合饲料的卫生安全指标应符合GB 14924.2和NY5072的规定。f）斑马鱼疾病处理：对于患病的斑马鱼不做任何疾病处理，发现患病个体应立即隔离并人道地处死。g）驯养期间，亲鱼的整体死亡率不超过10%时，该批鱼可以使用；超过10%，应舍弃整批鱼并人道地处 死。7.1.3斑马鱼鱼卵的繁殖和孵育a）第一天，斑马鱼饲养房间灯光关闭前5小时左右，将亲鱼放在斑马鱼繁殖容器内做繁殖前适应性饲养， 期间雌雄亲鱼以网格板或透明板隔开，雌雄比例为2:1，密度不超过3尾鱼/L，不喂食。b）第二天，斑马鱼饲养房间的灯光开启后10分钟内，移除繁
10、殖容器中隔开雄鱼和雌鱼的网格或挡板，让斑 马鱼开始繁殖。繁殖开始后1个小时左右将亲鱼从繁殖容器中拿掉，收集鱼卵。将存活的鱼卵用成鱼养殖用水清 洗干净后，放入惰性材料制成的容器（如培养皿、培养罐等）中进行孵育。鱼卵应在容器底部稀疏地分布，不 能紧密聚集，液面高度以不超过容器的2/3为宜。将容器放在温度可控的环境中进行孵育，容器的水温控制在 26-28.5 C。c）鱼卵收集后6小时应再次检查，清理死亡的鱼卵。此后，每天检查并清理一次死亡的鱼卵，同时每次更 换至少2/3的水体。斑马鱼开始孵化后，换水时要将卵膜清理干净。d）在孵育过程中，如果要移动鱼卵/幼鱼，推荐使用巴斯德吸量管。在换水或移动鱼卵/幼
11、鱼的过程中， 尽量避免让鱼直接暴露在空气中。早期发育阶段的正常鱼卵和死亡鱼卵的典型图片见附录A的图1和图2。7.2试验用水7.2.1水质a）成鱼养殖用水。将饮用水净化处理后（反渗透水、去离子水或双蒸水均可），每升水加入400mg左右 的人工海盐和10mg左右的NaHCO3即可作为成鱼养殖用水，人工海盐和NaHCO3的用量可根据根据水质情况适当 进行调整。水体的电导率维持在450-550时/cm，pH维持在6.8-7.5，总硬度（以CaCO3计）维持在50-100 mg/L。 饮用水水质应符合GB 5749的规定。b）鱼卵和幼鱼孵育使用E3培养液（60XE3培养液配制方法：NaCl： 344 m
12、g，KCl： 15.2 mg，CaCl2 2H2O： 58 mg，MgSO4 , 7H2O： 98 mg，定容至20 mL）。c）E3培养液也可用作试验用水，用于配制受试物贮备液和配制试验溶液。7.2.2试验溶液a）试验溶液尽量用试验用水配制，受试物难以用水溶解时方可考虑使用低毒的助溶剂或分散剂。推荐的 溶剂有：二甲基亚砜、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。适合的分散剂有：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐 温80、0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化氢化蓖麻油。当使用某种助溶剂时，所有组别中的助溶剂浓度应该保 持一致，且浓度不大于1% （W/V或V/V）。同时，应加设溶剂对照组试验，溶剂对照组不能对斑
13、马鱼的存活有 明显影响或其它任何可观察的不利影响，也不能对试验结果有显著性影响。b）试验中不需要调节试验溶液的pH值。如果加入受试物后试验溶液的pH值有明显变化，按照GB/T 21808 中6.3.2的相关规定对受试物贮备液的pH进行调节。c）如果试验溶液富含营养物质，容易腐败变质，且无法通过换液来遏制水体变质，可考虑加入一定量的 亚甲基蓝来抑菌，以减缓水质恶化。如果使用亚甲基蓝，溶液中的终浓度应不大于0.1 ppm （即100艇/L），且 所有试验组的终浓度应保持一致。d）小分子单体化合物的检测浓度上限为1000 哽/mL，混合物或分子量3 KD的大分子化合物的测试浓度 上限为2000 哽/
14、mL。对于很难溶解或均匀分散的物质、分子也3 KD的大分子化合物，均不适合采用水溶暴露 方式，应考虑采用其它方式进行处理。e）如果受试物溶解后颜色较深，则需要稀释至浅色；如果受试物溶解后有颗粒，则需要稀释至无肉眼可 见的颗粒；同时需要考虑在最终计算数据是否要扣除受试物的本底值。8试验程序8.1准备8.1.1斑马鱼幼鱼的选取试验开始时，选择选取体型和行为正常、体长接近的受精后3天斑马鱼，放入24孔细胞培养板中，斑马鱼最 大负荷不超过10尾/mL。8.1.2暴露条件a）持续时间：从加入受试物开始，持续暴露20小时。暴露期间不投饵。b）光照：暴露期间避光处理，避免光照对受试物稳定性的影响。c）更换试
15、验溶液：通常暴露时间在24小时及以内不需要更换溶液。如果受试物富含营养物质，试验溶液 容易腐败变质，可考虑换液，换液频率可根据水质情况调整。d）水温：26-28.5 C。e）溶解氧：6 mg/L-饱和溶解氧。f）pH： 6.8-7.5。8.1.3预试验a）预试验用于确定受试物的NOE C浓度，为后续正式试验的浓度设置提供参考。以几何级数浓度系列设置 5个初始受试物浓度，浓度的间隔系熊3.2。b）向24孔培养板的每个孔中加入适量的受试物储备液，用E3培养液稀释成一组适宜的浓度系列。另外置 一个E3培养液对照组。如果必须使用助溶剂，所有组别中的助溶剂浓度应保持相同，还应设置一个相应的助溶 剂对照组
16、。每个孔1mL溶液，每个孔均放入10尾受精后3天的斑马鱼。如果一次试验需要使用多个24孔培养板时，每个板上至少需要设置一个E3培养液对照组或一个助溶剂对照 组。c）在暴露开始后1小时、8小时和20小时进行观察，及时清除死亡的斑马鱼，并对斑马鱼的死亡和其它 毒性效应进行记录，确定受试物的NOEC。在最后一次观察时，向水溶液中加入麻醉剂，将斑马鱼麻醉后在普 通体视显微镜的明场下观察（推荐使用三卡因作为麻醉剂，三卡因的使用浓度不超过160 gg/mL），观察时斑马 鱼应头朝左、腹部朝下、完全侧躺，所有斑马鱼的体位应该保持一致。死亡判断标准：静止不动、无心脏跳动、躯干呈白色不透明颜色、对机械刺激无反应
17、。异常表型：心包水肿、血流缺列减少、出血、脑变性/萎缩/水肿、下颌畸形、眼畸形/水肿、肝脏变性/肿大 /萎缩、卵黄囊吸收延迟、躯干弯曲/缩短、肌肉变性、鳔未充气。异常表型的典型图详见附录A的图3-图6。异常行为学指标：身体侧翻、游动剧烈。8.2正式试验8.2.1试验分组正常对照组：含检测试剂和斑马鱼。阳性对照组：含有阳性对照样品、检测试剂和斑马鱼，每次试验设置一个阳性对照组即可。受试物测试组：含有受试物、检测试剂和斑马鱼，受试物根据需要设置多个不同的浓度组。溶剂对照组：含有溶剂、检测试剂和斑马鱼；如果受试物配制过程中使用了助溶剂或分散剂，则应设置该 组。检测试剂对照组：只有检测试剂，没有斑马鱼
18、和受试物；设置该试验组是为了排除检测试剂自身的干扰， 检测试剂的浓度与受试物测试组相同。受试物对照组：含有受试物，没有斑马鱼和检测试剂；当受试物自身的颜色、不溶性颗粒物或荧光对结果 有干扰时应设置该组，受试物的浓度跟受试物测试组对应。8.2.2受试物浓度设置根据预试验的结果，确定正式试验的受试物浓度范围，试验最高浓度组不得高于NOEC 值或该类受试物的测试浓度上限（详见7.2.2.d）。以几何级数浓度系列设置至少3个不同的浓度组，浓度的间隔 系数3.2。浓度组别设置少于3个时需说明理由。8.2.3受试物处理根据试验需求，预先筛选好足够数量的受精后3天斑马鱼，将斑马鱼随机分配到24孔细胞培 养板
19、中，每个孔10尾斑马鱼。向E3培养液中加入受试物，使各试验组受试物的终浓度与预先设定的浓度一致。 同时设置阳性对照组和正常对照组，并在必要时设置溶剂对照组。向各组中均加入检测试剂CM-H2DCFDA， 试剂终浓度相同（推荐浓度为0.5 pg/mL），所有组别的溶液体积都是2 mL。充分混匀后，将斑马鱼从24孔细胞培养板中转移至96孔黑色酶标板中，每孔1尾斑马鱼，每孔150 pL溶液， 每个试验组至少10个复孔。同时，在96孔酶标板上设置检测试剂对照组，设置3个平行复孔。如果在试验前观察 到受试物自身有颜色、不溶性颗粒物或者荧光，可能对试验结果产生影响，则需要考虑在96孔酶标板上设置多 个不同浓
20、度的受试物对照组，受试物的浓度跟受试物测试组一一对应，每个浓度设置3个平行复孔即可。转移完 成后，将96孔酶标板用铝箔纸包裹，在生化培养箱中避光孵育20小时至试验终点。8.2.4酶标仪检测 至试验终点，用酶标仪检测各试验组的荧光信号值。选择符合检测DCF荧光信号要求的激 发波长和发射波长。每组的有效数据不少于8个。受试物测试组的荧光信号值减去检测试剂对照组的荧光信号值 （如果设置了受试物对照组，还应减去受试物对照组的数值，以排除受试物自身的干扰），CM-H2DCFDA被 斑马鱼体内ROS氧化形成的DCF的荧光信号值。8.2.5注意事项 每次试验前需要检测一次受试物溶液的溶解氧和pH，试验过程及
21、终点不需要再次检测。在转 移斑马鱼的时候，要注意避免损伤到斑马鱼。9结果评价9.1数据处理9.1.1统计学分析将酶标仪检测到的荧光信号值记为F，统计学处理结果用mean SE表示。如果受试物自身的性状（颜色、 溶解性、自体荧光）对结果没有干扰，将受试物测试组与正常对照组的数据直接进行比较；如果受试物自身的 性状（颜色、溶解性、自体荧光）对结果有干扰，应先从受试物测试组的每个数据中减去受试物对照组的平均 值，然后再与正常对照组的数据进行比较。一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验， 方差齐，计算F值，F值 F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值NF0.05，PW0.05
22、，用多个实验组 和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态 或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行 统计。9.1.2抗氧化功能的定量计算根据酶标仪检测到的荧光信号值，计算受试物的抗氧化作用（以ROS清除率表示），公式如下:ROS清除率（）=（1 F（受试物测试组）F（检测试剂对照组）x 100%F （正常对照组）-F （检测试剂对照组）(1),(2),ROS清除率（）F （受试物测试组）-F （受试物对照组）-F （检测试剂对照组）x八-F （正常对照组）-F （检测试剂对照组）x
23、式中F为荧光信号值。受试物自身的性状对结果没有干扰时用公式（1），受试物自身的性状对结果有干扰 时用公式（2）。如果受试物配制过程中使用了助溶剂，则公式中的正常对照组数值用溶剂对照组数值进行替换。 9.2结果判定及说明9.2.1当一个受试物的试验结果满足下列要求时，可以判定该受试物有抗氧化功能：受试物测试组至少有一组的荧光信号值与正常对照组相比有统计学上的显著性差异，即p 0.05。9.2.2 ROS清除率的定量计算结果不作为判定受试物是否有抗氧化功能的依据，仅用于比较不同受试物之间抗 氧化功能的强弱。10保证试验有效性的条件 10.1预试验中，E3培养液对照组一一如果使用了助溶剂，也包括溶剂
24、对照组一一斑马鱼的死亡率或异常率不 得超过10%，超过10%则该次试验视为失败；10.2正式试验中，阳性对照组与正常对照组之间存在统计学上的显著性差异，且平均值之差必须大于2倍的正 常对照组内标准偏差（SD）；否则，该次试验视为失败。10.3正式试验中，如果使用了助溶剂，溶剂对照组与正常对照组之间不能存在统计学上的显著性差异，如果 溶剂对照组与正常对照组之间存在统计学上的显著性差异，则该次试验视为失败。11试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a）检验依据；b）样品和阳性对照的信息，包括与试验操作相关的理化性状；c）斑马鱼来源和品系等相关信息；d）试验条件和方法，包括试验具体步骤；e）
25、试验的日期；f）数据处理与结果评价方法；g）结论。附录A（资料性附录）斑马鱼典型图图A.1为在28.5C环境下的正常斑马鱼早期发育图，其中：a）为单细胞期（受精后0.2 h左右）；b）为二细胞期（受精后0.75 h左右）；c）为胚盾期（从侧面观察，受精后6h左右）；d）为原基-6期（受精后25h左右）。图A.1在28.5C环境下的正常斑马鱼早期发育图图A.2为斑马鱼早期发育阶段的致死指标代表图，其中：a）为卵凝结；3中*表示为心包水肿，箭头所指为体节；c）中*表示为眼芽缺失，箭头所指为尾部未分离。图A.2来自OECD No.236。图2.斑马鱼早期发育阶段的致死指标代表图图A.3为受精后3天和4天的整体图，箭头所指为与正常斑马鱼相比异常的表型。受精后3天的斑马色受精后4天的斑马鱼正常斑马鱼心包水肿图A.3受精后3d和4d的整体图图A.4为斑马鱼肝脏局部图，其中：a）为正常斑马鱼；b）为出现肝脏发黑（变性）和卵黄囊吸收延迟的斑 马鱼，虚线1所示为肝脏，虚线2所示为卵黄囊。图A.4斑马鱼肝脏局部图图A.5为斑马鱼肌肉变性典型图，其中：a）为正常斑马鱼，b）为出现肌肉变性（肌肉纹理不清晰、表面不图A.5斑马鱼肌肉变性典型图图A.6为斑马鱼肌肉变性典型图，其中：a）为正常斑马鱼，b）为A图为出现下颌畸形（下颌发育延迟，不 能与上颌咬合）的斑马鱼。图A,6斑马鱼下颌畸形典型图
