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1、11 植物种质离体保存,1,11.1 概述,种质资源(germpalsm resources)基因资源(gene resources)遗传资源(genetic resources)指包含一定的遗传物质，表现一定的优良性状，并能将其遗传性状传递给后代的植物资源的总和。,2,种质资源研究的类型 群 体 个 体 性 状 细 胞 基 因,3,从来源上看，种质资源包括（1）自然资源中的植物材料；（2）人工创造的植物材料：栽培品种、中试品种、育种的中间材料、育种工作的基础材料。,4,种质保存的意义 随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂
2、草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良和农业持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。,5,中国特有植物,银杏、水杉珙(gong)桐,6,金花茶,毛华菊,7,种质资源的保存方法,原地保存 指在植物资源丰富的地区,在种质资源原来所处的生态环境中，不经迁移，建立自然保护区、原地保存林等,采取措施加以保护。(2)异地保存（种质圃保存）将种质材料迁出自然生长地，集中改种在植物园、树木园、品种资源圃、种质资源圃等处保存。,8,9,(3)种子保存(4)离体保存(5)基因文库保存,设施保存 将种质材料大批量贮藏于一个较小的、可以人工
3、控制的空间,并能安全地保存种质30 50 年以上,具有种质不易丢失、便于交换和利用等特点。,种子保存（贮藏保存）,用控制贮藏条件（温度和湿度）的方法保持种质资源的生活力。温度300，每降低5，种子的寿命延长1倍。种子含水量14-4%，每减少1%，种子的寿命延长1倍。,10,资源库 温度 湿度 种子贮藏方式与时间短期库 4 50%纸袋中可保存5年中期库-6-2 40-50%密闭容器内保存20年长期库-1015 35%真空包装中保存70年,11,利用试管保存的优点：,所需空间小可以解决常规方法不易保存的种质资源。繁殖时不受季节限制，繁殖速度快。培养物不带病虫害，便于种质交流。,离体保存(试管保存）
4、,是在适宜条件下，用试管保存植物的组织和细胞的培养物。,12,13,对于难以产生或不产生种子的无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、大蒜、生姜等，以及含水量较高的种子如洋葱、芹菜、结球甘蓝等作物的种子，在脱水后即死亡，自然状态下繁殖，不可能保存全部的基因型。对于这些作物的种质保存，采取的方法都是离体保存。,14,利用DNA重组技术，将种质材料的总DNA或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个DNA片断的克隆。,基 因 文 库 保 存,基因文库技术,15,基因组DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(cDNA library),基因文库(g
5、ene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,著名的种质资源数据库：芬兰、瑞典、挪威、冰岛、丹麦共同建立的北欧五国作物种质资源数据库日本农林水产省的作物种质资源信息系统美国农业部的作物种质资源信息网络系统中国国家作物种质资源数据库系统菲律宾国际水稻所的国际水稻种质资源数据库,种质资源数据库,19,20,很多国家从上世纪50 年代以来十分重视资源的收集和保存。1958 年建成的美国国家种质库是世界上第一座现代化种质库,该库于1992 年扩建成库容100 万份的现代化国家种质库,已保存各类
6、植物种质资源55万份。,21,英国皇家植物园邱园的千年种子库工程(M SBP),是目前世界上最大的种质设施保存库。该库于2001 年建成并投入使用,MSBP 计划到2010年使得全世界干旱地区2.4 万种以上(约10%)的植物种子得到收集和保存,目前已收集保存了全英国95%的植物种质资源,并与澳大利亚、埃及、肯尼亚、南非等12 个国家开展了合作,收集以干旱地区为主的植物种质资源。,22,发展中国家印度也于1976 年成立国家植物种质资源局(NBPGR),下设30 个单位组成全印植物种质资源保存体系,已保存20 万份种质,每年用于植物种质资源保存维护费110 万美元,1997 年建成库容100万
7、份的国家植物种质资源库,成为世界植物种质资源大国。,23,中国农科院在1984 年和1986 年分两期在北京建立了一座较大型的国家农作物种质库,包括一座长期库和一座中期库,而于90 年代初又在青海建立了一个“复份库”,至2000 年,已保存了33 万份材。,24,中国作物种质资源信息系统（CGRIS），拥有粮食、纤维、油料、蔬菜、果树、糖、烟、茶、桑、牧草、绿肥、热作等180种作物、39万份品种/种质/基因信息。,中国作物种质信息网/,25,中国西南野生生物种质资源库2008年4月29日在中国科学院昆明植物研究所建成，于10月29日宣布投入运行。三万多种植物以及丰富的动物种质资源得以“多世同堂
8、”。中国西南野生生物种质资源库从筹建 到竣工历时年，项目总投资1.48亿，建筑面积约7000平方米，园区80亩。项目建设包括种子库、植物离体库、微生物库、动物种质资源库、DNA库。,中国西南野生生物种质资源库,26,中国首个数字化的热带亚热带植物种质资源库2008年7月在广州建成新引种热带亚热带珍稀植物800多种，包括华南植物园活植物数据库，入库数据达11000条以上。建立了植物的成年植株、小苗、种子、插条、器官组织、DNA、有效化学成分等的保存技术体系。,1996年4月中国科学院典型培养物保藏委员会(TCC/CAS)用三年时间(1996-1998)筹建中国科学院植物离体种质库。主要工作是收集
9、、保存植物离体种质，研究其快速繁殖方法和保存技术。目前能够提供部分所保存的试管植物原种和其快速繁殖技术；已初步建成的植物组织培养文献数据库可供查询；并欢迎进行有关快速繁殖和离体种质保存技术的合作研究。本库现保存各种培养物250种左右，包括蕨类植物56种，苦苣苔科植物31种，食虫植物17种，猕猴桃属植物35种，各种观赏植物48种，工程植物59种。,朱 至 清,27,28,11.2 植物材料的离体保存,常用的离体保存方法是缓慢生长保存和超低温保存。前者适合中短期保存，后者用于长期保存。,11.2.1 植物材料离体保存的方法,缓慢生长保存 指改变培养物生长的外界环境条件，使细胞生长降至最小限度，但不
10、死亡，从而延长继代培养时间。优点是：使保存材料维持不断生长，取出部分材料进行鉴定或用于育种之后，还有保存的材料。,29,常温抑制生长保存,中低温调控生长保存,常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合,30,改变生长温度抑制生长,缓慢生长保存,常温抑制生长保存 降低培养基中无机盐浓度（1/4 MS、1/2MS),添加一定量生长抑制剂，如脱落酸(ABA)、矮壮素（2-氯乙基三甲基氯化铵，CCC）、多效唑（PP333）、高效唑（3307）、二甲基氨琥珀酸（B9）、TIBA、膦甘酸、甲基丁二酸等,也可以加入甘露醇（1-5%）、山梨醇、高浓度蔗糖（2-4%）等，延缓生长，保持活力达到一年以上。,31,
11、温度:2025,中低温调控生长保存 在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。低温保存,32,温度:015,温度:0-80,33,19 世纪末,诞生了一门新的科学低温生物学(Cryobiology)。1949 年发现了甘油可以防止冰冻对活细胞的伤害,对低温生物学有重要贡献。从此，在许多不同领域内广泛应用低温保护技术。,低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。,超低温保存,（ultra-low temperature）通常指低于-80的低温，主要是液氮（-196）及液氮蒸
12、汽相（-140）。,34,超低温保存常用的冷源有干冰(-79)、超低温冰箱(-80-150)、液氮(-196)等。,超低温保存已经证明是一种长期保存高产细胞系的有效方法。,超低温保存生物材料的报道可追溯到18世纪。但直到1973年Nag和Street首次成功地在液氮中保存了胡萝卜悬浮细胞，植物种质超低温保存才取得突破性进展。,35,1922 年Knowlton 首先报道了-180 贮存后的金鱼草(Antirrhinum majus)花粉仍具有生活力,同时发现降低花粉含水量能够提高冰冻保存的生存率。,已对许多植物展开了这方面的研究，涉及保存的材料有：原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细胞胚、胚、花
13、粉胚、花粉、茎尖（根尖）分生组织、芽、茎段、种子等。,36,超低温保存的植物种类 超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。,37,38,超低温离体保存的机理,种质超低温保存成功的关键在于：降温冰冻过程中避免细胞内结冰；化冻过程中减少次生结冰。,在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，仅保存细胞的活力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。因此可以长期保存植物材料。,39,控制降温冰冻速度及添加冰冻保护剂对防止细胞内结冰至关重要。可以促进保存材料组织在结冰早期进行保护性脱水,阻止冰晶
14、生长,达到玻璃化状态。,细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的6090，由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90，很容易冻结。,40,理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-15，细胞内游离水的冻结在-25。-30 时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在-100 温度下也不冻结。,41,冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冰晶中心，一般在-20-60范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到-140时完全停止增长。,42,溶液经晶核形成和晶核生长过程而固化。溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷
15、的溶液，它是低于冰点而不结冰的液态。继续降温，均一晶核开始形成，这时候的温度叫均一晶核形成温度，即过冷点。如果降温速度不够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定形的玻璃化状，是一种透明的固态，称为玻璃态，此时的温度叫做玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有因冰晶的形成对细胞造成的机械损害。,43,1.生物细胞在有防冻剂存在的降温过程中,随着温度降低,细胞液逐渐结冰。-10 时细胞外介质结冰已基本完成,而细胞内尚未结冰,从而造成细胞内外的蒸气压差,这时只要降温速率不太快,细胞内的水不断向细胞外扩散
16、,细胞原生质浓缩,就会降低细胞内含物的冰点,这种逐渐除去细胞内水分的过程称为“保护性脱水”。能有效地阻止在细胞质或液态中结冰。,降温时的三种情况,44,2.此时若冷却的速度加快(10/min),细胞内的自由水来不及扩散到周围溶液,细胞内就产生大量的冰晶,产生冰害,导致细胞死亡。3.但如果降温速度很快,细胞质溶液“固化”,细胞内形成对细胞不致伤害的微小冰晶或仍保持非结晶状态,这种现象称为玻璃化,这时细胞内的水不是冰晶,而是玻璃态的水,对细胞器和细胞膜不构成直接伤害。细胞内含物一旦发生玻璃化就能避免细胞内结冰,从而达到超低温保存效果。,目前常用的超低温保存方法可分为两类 冷冻诱导保护性脱水的超低温
17、保存 玻璃化处理的超低温保存,45,11.3 超低温保存的程序,（1）培养材料的准备（2）预处理（3）添加冷冻保护剂（4）采取不同的 冰冻方法及保存（5）化冻处理（6）细胞活力和变异的评价（7）植株再生,46,11.3.1 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存程序,三个重要操作步骤：(1)细胞预冻；(2)细胞在-196 下长期贮存；(3)细胞解冻。,47,针对不同种类的植物材料，筛选适合的冰冻保护剂 采用适当的降温冰冻速度 采用适当的化冻方式 使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。,48,（1）保存材料的选择 花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。（2）冷冻前
18、材料预处理（预 培养）为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处理。预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸的培养基上，在接近0培养数日。,49,预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。,50,51,（cryoprotective agent，CPA）一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂，也称作抗冻剂，对低温保存很重要。,（3）添加冷冻防护剂,冰冻保护剂具有以下特点：易溶于水，对细胞无
19、毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用：主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。,52,渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。常用的有：甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。,53,渗透型冰冻保护剂的使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同。,非渗透型冰冻保护剂的特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，起到保护作用。此类
20、冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。,54,非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮（polyvingyl pyrollidone，PVP）蔗糖（sucrose）葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）白蛋白（albumin）羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）,55,（4）冷冻处理方法,快速冷冻法,慢速冷冻法,预冷冻法,干燥冷冻法,56,快速冷冻法：将植物材料从0或其它的预处理温度直接投入液氮中保存的方法。植物体内水分从-20-140范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到-140时完全停止增长。关键是利用高速降温
21、越过冰晶增长的危险温度区，这样就不能形成致死的冰晶。,降温速率为1000/min,57,慢速降温法：将植物材料从0或其它的预处理温度以1-2/min降到-100，稳定1h后再投入液氮中保存。缓慢冷冻，细胞内的自由水扩散到细胞外的冰晶表面，并形成冰，使细胞发生保护性的脱水，避免在细胞内形成冰晶，这样细胞可以存活。,58,预冷冻法：投入液氮前，需要经过短暂时间的低温锻炼。,59,将种质材料在添加保护剂(如蔗糖、二甲亚砜、甘油等)后置于低温冰箱或液氮蒸汽箱(-10-70)中冰冻若干小时后投入液氮贮存。,60,两步法:种质材料在添加保护剂后,用程序降温仪以某个速率(每分钟0.1 0.5)降温至转移温度
22、(-40-70),然后投入液氮中贮存。,逐级冷冻：材料通过不同温度等级降温至-40，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。,干燥冷冻：将材料置于27-29的烘箱内，或用干燥硅胶 降低植物含水量后，再投入液氮中保存的方法，可以防止植物冻死。,61,（5）化冻方法 液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。,62,解冻速度是解冻技术关键，一般在37的热水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。,63,生长季节中的材料，一般在3740 温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。木本植
23、物的冬芽，在超低温保存后，必须在0 低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。,64,保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再生植株。,65,（6）超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术 无论哪种种质资源的保存方法都是以保持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温保存过程中，植物材料是否发生变异是育种工作者十分关心的问题。,66,为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段进行有效的检测体系。形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记如RFLP和RAPD等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。,67
24、,（7）再培养 经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养12周，再转入正常光下培养。,68,再培养所用的培养基 一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。,69,一般为愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖,70,11.3.2 玻璃化冻存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。,71,用玻璃化法冻存程序是：（1）使用冷冻保护剂溶液对材料进行预处理；（2）然后用玻璃化溶液进行脱水处理；（3）
25、最后投入液氮保存。,1玻璃化法 是将生物材料直接经极高浓度的玻璃化保护剂快速脱水后，直接投入液氮。使生物材料在快速降温时胞内胞外都进入玻璃化态,而不形成冰晶,从而避免了细胞结构的破坏。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。,72,Sakai 1991 设计的玻璃化保护剂PVS230%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L 蔗糖+MS无激素培养基,73,2包埋脱水化法 茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包埋后,第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水,第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水,然后投入液氮贮存。可以保护材料的结构不会
26、遭到破坏。,74,优点：不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程不甚严格；同时避免了玻璃化法中二甲亚砜等高浓度保护剂对材料可能造成的损害；样品易于操作，被保存样品体积可以比较大；样品可获得较高的抗冻力，提高保存效果，使保存后的样品不经愈伤组织直接成苗，降低了变异的可能。,75,3包埋玻璃化法 是包埋脱水法和玻璃化法的结合。保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保存。材料存活率比用包埋脱水法要高，藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。,76,77,玻璃化冻存的材料在保存终止后，快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。,材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就
27、可保证冻存的成功。,新疆紫草高产细胞系的超低温保存程序（李国凤等，1992)1.将高产细胞系的愈伤组织放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（7.5%的二甲基亚砜0.5mol/L 山梨醇5%甘油5%蔗糖)密封试管，继续在冰浴中停留15min左右经过保护剂处理的愈伤组织，以1/min的速度冷却，从1降低到-40，在-40 停留2h后投入液氮罐-196 储存。,78,4.当需要使用细胞系时，将保存的愈伤组织用40 的温水浴快速化冻，并以消毒过的培养液彻底洗涤，5.接种到继代培养基上，在25下暗中培养，愈伤组织即可逐渐复苏，恢复生长。实验证明，在-196 的超低温条件下细胞系的生活力和高产特性可以长期保存下去。,79,80,20 世纪70 年代以来,植物资源超低温保存研究取得了很大的进展,为农业作物品种改良、快速繁殖及脱毒等奠定了基础。国内应用超低温保存技术研究的植物品种超过200 种,但至今还未建立起专有物种的种质资源库,缺乏植物材料的中长期保存研究及遗传稳定性研究。,81,超低温保存是一个非常复杂的过程，不同的植物，同一植物的不同材料类型，其保存的难易和效果都不相同。因此，在进行保存试验时，一定要根据材料本身的特性，对影响保存的因素进行研究，确定提高超低温保存成活率和再生率的有效途径和方法，达到成功保存种质资源的目的。,END！,82,
