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1、细胞工程,Cell Engineering,Chapter 4、动物细胞培养工程,41 概述 42 生产用动物细胞系43 培养液和培养环境44 动物细胞培养工艺45 动物细胞培养过程的放大与优化46 动物细胞代谢工程47 动物细胞工程产品制备及质控48 动物细胞工程表达产品的应用,41 概述,411 定义：动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规模生产基因工程药物，
2、单抗和疫苗等生物工程产品的关键技术。,412 发展历程：,413 动物细胞培养的特点与方法：,A、动物细胞培养的主要特点 动物细胞对营养要求高 血清来源受限，质量不稳，研发无血清培养液；动物细胞对培养环境适应性差 生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；,动物细胞培养对环境条件要求严格 pH，混合气体（O2、CO2、N2）；动物细胞培养过程易产生污染 要求苛刻；各种细胞长期培养易变异 需监测其形态、生长、表达过程；绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特征需载体。,附、植物细胞特性与细胞培养 与微生物比较，植物细胞大；悬浮培养时，植物细胞易结团，2mm，浓度高、粘度大，分泌粘多糖（硅油降低粘度
3、），产生泡沫，需消泡；细胞有壁，易受剪切力高的装置损伤；与微生物细胞相比，生长慢，周期长，分批2-3周，半连 续与连续2-3周；与微生物细胞比较，需光、好气，CO2/O2比要控制；单细胞3-5天分裂，1周小细胞团成愈伤组织，可转移至分 化培养基上；植物悬浮细胞生长与增殖可分为：延迟、对数生长、直线生长、减缓、静止、衰亡期；,B、动物细胞培养工程的方法,悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐 适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等方法 单层培养 滚瓶法：间歇接触培养液和空气 固定化培养 微珠 微载体培养 比表面积大 中空纤维,414 动物细胞培养工程技术现状与展望 A、70%生物技术产品使用动物细胞生产；B、
4、生产技术、工艺条件改变明显：培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变 为悬浮连续式；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。,C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）,中国，实验室规模 流加工艺：产量高易放大、操作简单，美国，产业 如Genentech、IDEC、化规模生产 MedImmune、Merk公司，蛋白质公司 连续灌注工艺：适合不稳定产品、培养利用低、操作复杂、产品回收大，如：Genzyme、Genetic Institute、Bayer公司,D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；（10000L规模、g
5、/L级）E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用,42 生产用动物细胞系 421 生产用动物细胞发展：生产用动物细胞是指按生产条件选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的历史演化。,422 生产用动物细胞的来源,423 常用生产用动物细胞的特性（参见下表）,424 生产用动物细胞库,生产用动物细胞库:是指为保证生产用动物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，能够长期、稳定地生产出符合要求的高
6、质量生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三级细胞库系统相应保存管理措施（档案和技术标准）。,bu,425 生产用动物细胞代谢工程优化改造,A、原因：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近天然构想，是生物自身的生长代谢特性并非最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性进行功利性修饰。,B、代谢工程（metabolic engineering）：是通过DNA重组技术和分子生物学手段改变酶系功能或物质转动功能，以改进细胞某些方面的代谢活性，进行精确目标的遗传操作。,C、具体优化改选措施：,构建在无血清
7、、无蛋白条件下增殖的细胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清是基本添加物，但含未确定成分，如有毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易污染）,敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产生，以改变细胞能量代谢途径；引入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性；构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）,将细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制蛋白基因p21和p27引入细胞，获得细胞周期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖周期达到调控细胞增殖目的；（参见下图）导入外源性糖基转移酶基因，改变细胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化修饰。,43 培养液与培养环境431 动物细胞培养条件,432 动物细胞培养液和添加剂,433 无血清无蛋白培养 优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程；缺点：比较贵，针对性强。,434 动物细胞培养用生物反应器,【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗 发酵罐与生物反应器 CHO、HNK与Vero 生长因子与贴附因子 2、简述生产用动物细胞系的来源及特点？3、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培养特性、条件与方式？,
