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1、切片法主要步骤1、取材与固定（1）取材：从动物体取下所需的器 官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材， 防止组织细胞自溶变性;取材的器械要锋利;所取材料力求小而薄（以 不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。（2）固定：将所取的材料立 即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成 分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组 织块变硬，便于进一步处理。常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或 混合固定液。实验室常用Bouin固定液，固定时间为1224小时， 其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。2、脱水与透明（1） 脱水：固定后的组织块内含
2、有的大量水分要彻底脱去，以便石蜡的浸 入。常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始， 逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。具体操作为：Bouin 固定液固定的组织块可直接进入70%的乙醇进行脱水，时间12小时 左右。（若材料暂不制片，可保存于70%乙醇中。）然后将组织块依 次移入85%乙醇（I）、（II ）各8-12小时，一95%乙醇（I）、（II） 各2小时，一 100%乙醇（I）、（II）各1小时。因无水乙醇对组织 有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时（2）透明：100% 酒精+二甲苯（1:1）30-40分钟，二甲苯（I） 15分钟一二甲苯（II） 15分钟（
3、易脆的组织可省略）。二甲苯的收缩性强，极易使组织变脆， 透明时间根据不同的组织适当调整。3透蜡：二甲苯+石蜡（1:1） 30 分钟，石蜡（1） 40分钟一石蜡（I） 30分钟浸蜡是将包埋剂取代 二甲苯渗透入整个组织的过程,通常在恒温箱中进行，恒温箱的温度应该设置成高于石蜡熔点23C。浸蜡的时间长短根据不同的组织器官适当调整。4包埋5切片：将凝固的蜡块修整成合适的方块，上下 边要平行，并固定在小木块上，切片厚度6-12um, 一般7-8um。切 片刀倾斜角一般以2030度为宜，切片时力要均匀一致，以每分钟 40-50转为宜。夏季切片时，为保持蜡块硬度，可把蜡块放于冰柜中， 切片时再取出；胶质成分
4、较多的组织蜡块，切片时可以用毛笔沾水往 冷却过的蜡块滴加后再切片，以保证切片的完整性。如果发现切片破 碎可能的原因有:组织过硬变脆，可能是由于脱水时间不适当，可先用 温水润泽，再用冰硬化，便可较顺利地切片；也可能由于浸蜡时温度过 高，造成组织过硬。6贴片：用洁净的纯净水（易掉片的用甘油蛋白） 贴片，放在45-50C左右（比石蜡的熔点略低，根据气温适当调整） 左右烘片台展平，入50C的干燥箱中烘干备用。7染色：二甲苯脱蜡（I） （10-20分钟，可长时间）一二甲苯脱蜡（II） （10-20分钟，可 长时间）一以下每步2-5分钟，也可长时间二甲苯：无水酒精1： 1 f无水酒精（I） T5%酒精90
5、%酒精80%酒精70%酒精蒸 馏水一苏木精或伊红染液（20-24分钟）一自来水冲洗一蒸馏水（2-5分 钟）一1%盐酸酒精（70%酒精+1%盐酸，在其中醮取几下）（然后蒸 馏水中沾洗几次，清除盐酸，防止下一步中和碱水）一 1%碱水（3-5 秒）至组织出现蓝色（目的：显蓝）一蒸馏水（2分钟）一70%酒精（2 分钟）一80%酒精（2分钟）一90%酒精（2分钟）一95%酒精（2分钟） 一0.5-1%的伊红染液复染（几秒至数分钟，根据伊红浓度和组织不同 而定，注意染色时间不能太长,3-5秒）一95%酒精（I）（分色2分钟 或更长，至胞浆和结缔组织等成桃红色）一95%酒精（II） （2分钟）一无 水酒精（
6、I） （2分钟）一无水酒精（II） （2分钟）一二甲苯（I） （2分钟） 一二甲苯（II） （2分钟）不同的生物及不同的组织以及相同组织的不 同生理阶段对染料的亲和力都有差异，所以分色和蓝化时间需要摸索， 可在显微镜下观察。染色结果细胞核蓝紫色，胶原纤维、肌纤维、嗜 酸性颗粒桃红色，胞浆桃红色，弹性纤维明亮桃红色。8封固：中性 树胶用二甲苯稀释，以能用吸管吸起为准，先将盖玻片一侧放置在滴 有中性树胶的组织切片上，随后缓慢放下并将空气完全排除，避免留下 气泡。斜面放置晾干。9观察和照相：在显微镜下观察，对好的视野 拍照，做好记录。05 4.10 DOX-HCL PELA-CD/DOX 胶束.HA
7、-PFI A-C1VDOX 给药 4H h以及1。天后各脏器的近红外成像图片(b)-controlrtM DOX -M- DOX-NPb .Tinw W*130 M30Tlmt (Sfi 4 3 2 4 62 3 2 2 9 ASEf 3图3膊 肿捕也配小片00.时揄休汉(b)反株鼠体Jt(C说时向的变化归技Fig. J-18 images of the? tumors (n) removed from mice at the end point of the research Turnu r-jcru wihchanges (b) and body weight changes (c of
8、txanoor-bcaring BzMLB.c mice after tall vdn uijcction ofDermal saline fircc DOX or DOX-NPs (at a DOX dme of4 mg kg ) The arrow n?prcscnes thebeginning time points of the dmg injection arid tbe? drug injection -was. repexiedl uvery 3 days. Dararepresent mcg 4 SD (ol7). (*P 0.0 L. *PU*a bed w itli LI m jm linuig ( X fiOCIA x tb ILeHA. r-riBfvaB vvarI w-M. 2： c-aamr wa g. wynffi 3电Stir 3蛔疝&匏的病理彩吝学变化FijR. 3 PjlMJiantjar|fliajik：itraiJ etiAlign irf tumor cvD* under c-lnrtirain m icOMrvqieA x tb ILeHA. r-riBivar I w-M. 42 c-aamr wa g. wyn
