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1、OncomirsmicroRNAs with a role in cancer.摘要：MicroRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是负调控基因表达。它们调节了多种生物学信号通路，生物信息学数据显示，每个miRNA 可以调节数百个靶基因，这也表明miRNAs 可能影响所有的信号途径。最近的证据表明，miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。研究表明miRNAs可以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，可能在癌症的诊断和治疗中起重要作用。肿瘤是由于细胞不受控制的增殖，受到损伤的细胞不能正常死亡引起的。细胞有几
2、种保护措施，保证在发育过程中和成体中的细胞通过一种协调的机制，进行正常的分裂，分化，和死亡。多种调控因子通过基因表达的开关，调节细胞分裂和分化。在肿瘤，被称为肿瘤抑制基因和癌基因表达失调。大多数肿瘤抑制基因和癌基因都是从DNA转录成RNA，然后翻译成蛋白质，行使其生物学功能。最近的证据表明，非编码蛋白的RNA 分子，被称为microRNAs (miRNAs)，也可以起到肿瘤抑制基因和癌基因的作用。我们正在开始了解这种新颖的基因调节机制如何参与肿瘤相关过程。在最近发现的数百种miRNAs 中，仅有一小部分从线虫、果蝇和人基因组来源的miRNAs 得到了较为清楚地研究。它们控制了细胞的生长、分化和
3、凋亡，因此，这些miRNAs 表达的失调与肿瘤发生有关。持续对miRNA 功能的研究，可以促进人们对肿瘤发生的具体机制的理解。在本综述中，我们讨论了“oncomirs”与癌症相关的miRNAs-领域的兴起,以及如何利用这些miRNAs对肿瘤进行诊断和治疗。miRNAs 是一大类基因表达调控因子miRNAs 是由约22 个核苷酸组成的非编码的单链RNAs，这是一类在动植物中新发现的基因表达调控因子。它们通过依赖于miRNA 和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达。当miRNAs 和编码蛋白质的mRNA 几乎完全配对时，miRNAs 诱导RNA介导（RNAi）的干扰途径。简而言之，m
4、RNA 转录本在miRNA 关联的多蛋白RNA 介导的沉默复合体（miRISC）中被核酸酶剪切，导致靶mRNA 的降解。这种miRNA 介导的基因沉默机制在植物中比较普遍，但在哺乳动物中也有发现。然而，绝大多数哺乳动物中的miRNAs 并不导致靶mRNA 的降解，而是通过另外一种机制进行基因表达调控的。这些miRNAs 通过不完全的碱基配对和mRNA 的3非翻译区（UTRs）,在一个类似于或者可能是等同于RNA 干扰途径中使用的RISC 复合物中，在转录后水平上抑制基因翻译。与抑制翻译一致的是，通过这种机制控制翻译的miRNAs 仅降低其靶基因的蛋白质表达水平，但其mRNA 水平几乎没有受到什
5、么影响。然而，最近的一些发现表明，miRNAs 与它们的靶基因只有部分互补的情形也会导致mRNA 的降解，但是目前还不清楚，翻译抑制是否发生在mRNA 的降解之前。miRNAs 的生物合成最近才得到了比较详细的阐明。miRNAs，通常是由RNA 聚合酶II (Pol II) 转录的，最初产物是被称为pri-miRNA 的大的前体分子。pri-miRNAs 在细胞核内被RNase III Drosha 和双链RNA 结合蛋白Pasha 处理成约70 个核苷酸组成的pre-miRNA，这种分子为一个不完全的茎环结构。RAN 和GTP 依赖的exportin 5 将这种前体分子输送到细胞质中。茎环结
6、构随后被另一个RNase III Dicer 处理，剪切产生约22 个核苷酸长度的miRNA：miRNA* 双链。然后这种双链很快被整合到miRISC 复合体中。成熟的miRNA 保留在具有功能的复合物中，对靶基因表达进行反向调控。在二十年前研究人员最初发现miRNAs 时，并没有意识到这些miRNAs 的重要性。因为，第一个在线虫中发现的在其生命周期中控制时序发育的miRNAs 基因lin-4 被认为是线虫中独有的。然而，通过传统的克隆方法和生物信息学手段发现在线虫、果蝇、哺乳动物中存在着数百个miRNAs，这引起了各领域科学家的重视。据估计，在人类基因组中至少存在300 个miRNAs(也
7、有可能为1000 个)，约占人类基因的1-4%，这使得其成为最大的一类基因表达调控因子。大多数人类的miRNAs 位于编码蛋白或者非编码蛋白的mRNA 转录本的内含子区域。其余的miRNAs 位于基因组的转录本之间，或者在mRNA 非编码的外显子区域，或者是mRNA3非翻译区域。此外，也有的几个miRNAs 聚集在一起，成为一个miRNA基因簇，如19 号染色体上的由54 个miRNAs 组成的一个基因簇。通过序列同源性可以对miRNAs 进行分组归类。研究发现，成熟miRNA 通常在5端同源性较高，但是同一个miRNA家族的成员是否调控类似的生物学过程仍需要进一步研究。很多miRNAs 在线
8、虫到人类的进化过程中是保守的，这预示着这些miRNAs 在发育过程和成体中引导了基本的生物学过程。miRNAs 调节多个靶基因目前的挑战是精确的鉴定miRNAs 所调节的靶基因。由于miRNAs 和其结合位点并不是完全互补的，可以存在短的错配和G-U 配对，因此，通过简单的BLAST 确定其靶基因是不可能的。但是，最近的生物信息学手段开始利用同一家族的成熟miRNAs 在5末端具有高度的同源性这一特点。数项研究表明，miRNA 的5末端对于miRNA 进入miRISC，并在其中保持稳定是非常重要的，而且，这一末端对于其生物学功能也相当关键。因此，大多数生物信息学算法利用一个包含了成熟miRNA
9、 的2-8 位的碱基序列的“miRNA seed”来搜索所有基因的3非编码区域的互补序列。这些研究发现一个单独的miRNA 可以结合多达200个靶基因，而这些靶基因可以行使不同的功能，包括转录因子，分泌蛋白，受体，转运蛋白。所以，miRNAs 可能控制着1/3 的人类基因的表达。然而，通过”miRNA seed”搜索会错过很多靶基因，有证据表明，在2-8 位核苷酸以外的变化也会影响miRNA 的调节功能。例如，整个成熟的let-7 miRNA 序列在线虫和人中是保守的，说明其3端也具有生物学功能。而且，我们实验室的突变研究发现let-7 miRNA 的5端和3端对于一个靶基因的调控都是必需的。
10、因此，已知的miRNA 的数目可能进一步的增加，如何确定预测所得的靶基因在生物学上确实与miRNA 相关也是一个难题。研究还发现单个基因的3非翻译区域具有几个miRNAs 的结合位点，这表明miRNAs 调控基因表达存在着复杂的组合模式。由于miRNAs 可能调节数个信号通路，这些小RNAs 的缺失或者异常表达可能与疾病密切相关，包括肿瘤。miRNA 相关的基因和人类肿瘤研究表明miRNA 生物合成的组成部分与肿瘤发生有关。在肺癌中发现Dicer 的表达下调。Karube 等检测了67 个非小细胞肺癌样品中的DICER 和DROSHA 的RNA 表达水平。他们发现DICER 的表达量下降与术后
11、存活期缩短相关，这表明了Dicer 可能阻止肺组织的转化。由于Dicer 与异染色质的维持和中心粒沉默有关，其蛋白质水平的降低可能直接导致基因组的不稳定，从而引起肿瘤形成。然而，Kanellopoulou 等最近证实缺少Dicer 的鼠胚胎干细胞尽管有异染色质不足的现象发生，但并不引起染色体的数目或者结构失常，并且注射这些缺少Dicer 的胚胎干细胞到裸鼠中也不会导致肿瘤发生。因此，Dicer 在肿瘤发生中的作用可能是非直接的，可能是通过其缺失而导致了具有肿瘤抑制因子效应的miRNAs 的减少起作用的。小鼠Dicer 基因的缺失研究表明这个基因在哺乳动物发育和干细胞正常分化、T 细胞发育、四肢
12、形成的重要性，这也预示着成熟的miRNAs 在这些过程中起作用。因此，肺癌和Dicer 的联系表明了这个基因在肺组织分化中的作用，并且可能它可能是通过miRNAs 起作用的。图一：miRNAs 的生物合成 microRNA (miRNA)基因通常是由RNA聚合酶II(Pol II)转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。这些pri-miRNA在RNase III Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70 个核苷酸组成的pre-miRNA前体产物。RAN-GTP和exportin 5 将这种前体分子输送到细胞质中。
13、随后，另一个RNase III Dicer 将其剪切产生约为22 个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入(miRISC)复合体中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的单链miRNA保留在这一复合物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达。与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往
14、引起靶mRNA的降解。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。蛋白Argonaute 是短的干扰RNA（siRNA）和miRNA 介导的基因调节RISC 复合物的至关重要的组成部分，也与多种肿瘤有关。3 个人的Argonaute 基因AGO3(又称真核转录起始因子2 亚基2(EIF2C3)，AGO1(又称EIF2C1)和AGO4(又称EIF2C4)，前后排列在1 号染色体(1p34-35)在wilms 肾癌中经常缺失，还与神经外胚层瘤有关。AGO1 在肺和肾的发育过程中高表达，在缺少Wilms 肿瘤抑制基因WT1 的肾癌中表达显著上升。这表明，AGO1
15、在这些组织在胚胎发生的分化过程中起重要作用。另一个Argonaute 基因，HIWI，与果蝇中piwi 功能类似的基因，定位在基因组12q24.33，而这一位点与睾丸生殖细胞肿瘤有关。这种睾丸特异表达的基因在19 份睾丸精原细胞瘤的12 份样品中表达上升。这些研究表明，HIWI 可能具有癌基因的活性，可能控制了生殖细胞的分裂和维持。进一步研究这个介导miRNA 加工和miRNA 抑制基因表达的复合物的组成部分对于设计利用miRNAs 治疗肿瘤等疾病的药物是必不可少的。miRNAs，生长、分化和疾病目前只有一小部分的miRNAs 生物学功能得到了阐明。这些miRNAs 调节了肿瘤有关的过程如细胞
16、生长，组织分化，所以，它们可能起到oncomirs 的功能。例如，由lin-4 和let-7编码的miRNAs 在线虫中控制了细胞分化和增殖的时序。这些miRNA 基因的突变导致了细胞周期和末端分化的异常，这也是肿瘤细胞的特性。有趣的是，哺乳动物lin-4 和let-7 的同源基因也被发现在人细胞系中控制细胞增殖，并与多种癌症有关。果蝇中由bantam 编码的miRNA 通过刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡来诱导组织生长，这与bona fide 癌基因的特性一致。然而，在人类中，没有bantam 的近似的同源基因。另一个果蝇的miRNA，miR-14，强烈抑制细胞凋亡，也具有癌基因的重要特点。此外，
17、miR-14看起来还具有不相关的调节脂肪代谢和严谨反应的功能。研究发现其他miRNAs 在发育和诱导细胞分化发挥基础作用。其中包括，miR-273 和lys-6 编码的miRNA，参与了线虫的神经系统发育过程；miR-430 参与了斑马鱼的大脑发育；miR-181 控制哺乳动物血细胞分化为B 细胞；miR-375 调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143 在脂肪细胞分化起作用；miR-196 参与了哺乳动物四肢形成，miR-1 基因与心脏发育有关。对于新的miRNA基因的分析，可能揭示其他参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进对癌症等人类疾病机制的研究。与癌症有关的miRNA
18、miRNA 表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作用。最近的研究发现，大约50%的得到注解的miRNAs 在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）。这说明miRNAs 在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。例如，mir-125b-1，线虫lin-4 的同源基因，在染色体的11q24 脆性位点，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中有缺失。Sonoki 等报道这一基因也和白血病相关，有一例前体B 细胞急性淋巴型白血病人在免疫球蛋白重链位点有这一基因的插入突变。尽管研究人员未能测定这一基因表达的改变，但是这一研究支持了这一基因的oncomir 功能
19、假设。Calin 等人首先发现miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因作用。他们研究发现，患有一种成年型B 细胞慢性淋巴型白血病（CLL）病人常有mir-15a 和mir-16-1 基因簇的缺失或是表达下调。65%的CLL 病人，50%的套细胞淋巴瘤病人，16-40%的骨髓瘤病人、60-%的前列腺癌病人中有13q14 位点的缺失。因此，在这个30Kb 的区域中必定有一个肿瘤抑制基因的存在。有趣的是，mir-15a 和mir-16-1 位于一个功能未知的被称为LEU2 的非编码蛋白的RNA 基因的内含子区域。临床研究早就发现，13q14 位点缺失的CLL 病人预后要好于染色体异常或是11q23 或是1
20、7p13 位点缺失的病人。这可能是由于mir-15a 和mir-16-1 的同源基因（mir-15b 和mir-16-2）存在于3 号染色体上。而这两个基因在CLL 病人有低水平的表达，因此，13q14 位点的缺失并没有造成这一家族的miRNA 的完全消除Climmino 等最近报道，miR-15a 和miR-16-1 负调控BCL2，这是一个抗凋亡基因，在多种肿瘤中过量表达，包括白血病和淋巴瘤。因此，这两个miRNAs 的缺失或下调，导致了BCL2 表达的升高，促进了白血病和淋巴瘤的发生。研究还发现，两个CLL 病人存在miR-16-1 前体的下游7 个碱基中有一个C 突变为T，这种突变导致
21、miR-16-1 表达水平下降，这进一步证明了其肿瘤抑制基因的作用。尽管对于miR-15a 和miR-16-1 生物学功能的进一步研究还未完成，证据显示，miR-16-1 表达水平的下降多发现在各种白血病中，而在其他组织来源的肿瘤中并不多见。这说明这个miRNA 在免疫系统和B 细胞分化中的作用。图二：MicroRNAs 可以起到肿瘤抑制基因和癌基因的作用 在正常组织中，miRNA 正常转录，加工，结合到靶mRNA 的互补位点，通过抑制蛋白翻译或是改变mRNA 的稳定性来抑制基因表达。最终的结果是，细胞生长、增殖、分化和死亡保持在一个正常的水平。一个起肿瘤抑制基因作用的miRNA 表达下降或者
22、缺失，导致肿瘤形成。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA 生物合成的任何步骤的缺陷造成的，而这最终将导致不适当的miRNA 的靶蛋白的表达。最后的结果可能导致过度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或者去分化，引起肿瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA 的过表达也将导致肿瘤发生。在这种情形下，在异常组织或是不适当的发育阶段这些miRNA 的表达增加，可能导致其靶基因（抑癌基因）的表达下降，引起肿瘤形成。miRNA 的表达增加，可能是由于miRNA 基因的扩增，持续性的启动子活性，miRNA 加工的效率增高，或是miRNA 的稳定性提高。 其他的研究也表明，miRNAs 的表达下调和肿瘤发
23、生有密切关系。例如，mir-143 和mir-145 在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，可能是由于其加工过程受到破坏。但是，mir-143 和mir-145 的肿瘤抑制基因功能可能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。另一个报道表明，miR-21 在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100 倍。反义核酸的研究发现这个miRNA 通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA 具有癌基因的功能。一项独立研究，利用芯片来检测肿瘤和正常组织的245 个
24、miRNAs 的表达水平，也发现胶质母细胞瘤中miR-21 表达升高。但是，由于mir-21 不是一个大脑特异性的基因，在乳腺癌样品中表达也有增加，这个基因可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。需要多项研究来证明这些miRNAs对于肿瘤发生时具有直接的作用还是仅仅在肿瘤中受到了异常的调节。let-7 家族负调控Ras由let-7 家族编码的miRNAs 是第一个被发现的可以调节癌基因Ras 基因表达的oncomirs。Ras 蛋白是一个膜相关的GTPase信号蛋白，调节细胞生长、分化。大约有15-30%的人类肿瘤都含有Ras 突变，而激活的突变导致这个蛋白表达上升可以引起细胞转化。因此，一个能够调节
25、这些潜在的癌基因表达的miRNA，可以控制细胞的增殖速度。在人类基因组中存在12 个由let-7 同源基因家族编码的miRNAs，可能起到抑癌基因的作用。研究还发现其与肺癌、乳腺癌、子宫癌等有关的脆性位点有联系。更直接的证据是，Takamizawa等发现人的肺癌中的let-7 同源物的表达显著减少，并且这导致更差的预后。这些研究进一步说明let-7 可以用于诊断，因为非小细胞肺癌病人的let-7 表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的增加let-7 可以抑制细胞的增殖，这也说明let-7 在肺组织中可能是一个抑癌基因。因此，可以考虑使用let-7
26、 来治疗肺癌。线虫实验为研究let-7 家族如何控制细胞的增殖提供了线索。特定的let-7 家族成员与Ras 具有遗传学上的相互作用，并且其表达是此消彼长的。此外，Ras 的3非翻译区域具有多个let-7 家族的互补结合位点。我们也证明了在人类细胞中let-7 负调控Ras。在人的肿瘤细胞中过表达let-7 导致Ras 表达下降。而减少let-7 的表达，会导致Ras 蛋白明显增加。我们还发现let-7 通过3非翻译区域直接抑制了Ras 表达。含有Ras3UTR 报告基因载体在翻译水平上受到了let-7 的抑制，而let-7 的抑制剂可以逆转这一作用。而且，对比人类肺癌和癌旁正常组织的let-
27、7 和Ras 表达水平，发现其表达是相反的：let-7 同源基因在肿瘤中表达下降，而Ras 表达增加。综上以上情况，这些研究表明，let-7 对于Ras 激活的肺癌可能是一个有前途治疗药物。并且，let-7 的表达下降可能是肺癌特有的。对于21 个不同肿瘤病人分析表明，12 个肺癌病人的肺癌样品中的let-7 表达均显著降低，而在其他肿瘤病人中只有零星的降低。此外，167 个miRNAs 的表达谱芯片研究表明，肺癌中的大多数miRNAs 基因表达并没有发生改变。与MYC 癌基因有关的miRNAsMYC 癌基因，编码一个基本的转录因子，在人的肿瘤样品中常常有突变或者表达增加，并且这一基因也被证明
28、是一个细胞生长的重要调节因子，因为其能够诱导细胞增殖和凋亡。有趣的是，miRNAs 和MYC 的表达增加有着紧密联系，并且这会导致B 细胞的恶性增殖。例如，当MYC 异位到mir-142 位点会导致一种侵入性的B 细胞白血病。这种异位导致MYC位于miRNA 的发夹结构的下游，其转录受到miRNA 启动子的控制。当MYC 异位到这一位点后，使得miRNA 前体分子下游的20 个核苷酸保守区域的丢失，破坏了miRNA 的加工，导致MYC 表达上调，并引起B 细胞的转化。另一个miRNA，miR-155，也和MYC 在B 细胞中的高表达有关。这个miRNA 是由BIC 基因的241-262 核苷酸
29、编码的。这个基因最初发现是禽类白血病病毒的整合位点，而后发现在B 细胞淋巴瘤中过表达。数年间，研究人员感到困惑，这种非蛋白编码的在禽类、小鼠和人的基因组中并不保守的RNA 是如何促进淋巴瘤形成和MYC 表达的。Metzler 等人发现，在BIC 上具有一段138 个核苷酸的保守序列，编码了mir-155 的发夹结构。该研究组还发现在儿科Burkitt 淋巴瘤中，表达量上升了100 倍，此外的研究也发现，Hodgkin 淋巴瘤等肿瘤中miR-115 水平也有提高。因此，mir-115 可以作为一个癌基因和MYC 协同作用，而其正常功能是在B 细胞的选择中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC 信
30、号通路的基因。在乳腺癌中也有报道miR-155 上调，这预示着这个基因在血液系统外也有功能。而且，mir-115/BIC 基因的结构类似于mir-15a 和mir-16-1 基因，这是由非编码蛋白的LEU2 基因的内含子部分编码的，另外，C13orf25 的情形也是类似的，其上含有mir-17-92 基因簇。不过一个非编码蛋白的包含miRNAs 的转录本和肿瘤发生之间的关系还不是很清楚。He 和ODonnell 等人最近发表的两篇论文更直接的描述了miRNAs、MYC 和癌症之间的关系。在散布的B 细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常常13q31 位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一
31、的基因就是一个非编码蛋白的RNA，C13orf25，这个转录本编码了mir-17-92 基因簇，其中包含了7 个miRNAs：miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，and miR-92-1。He 和他同事分析了具有13q31 扩增的细胞系的191 个miRNAs，发现其中有6 个miRNA 的表达增加，其中5 个属于mir-17-92基因簇。此研究组还发现，在65%的B 细胞淋巴瘤细胞样品mir-17-92 的前体分子表达增加。他们由此推断，这个基因簇的过表达与肿瘤形成有关。为直接检验这一假设，研究人员利用一个逆转录病毒系统
32、在带有Myc 转基因的小鼠血细胞(HSCs)表达mir-17-19-b1(mir-17-92 基因簇的一部分)基因簇。野生型小鼠接受了一个亚致死剂量的射线照射，去除所有的骨髓细胞，然后移植那些逆转录病毒转染的HSCs。移植了带有mir-17-19-b1 基因簇和Myc 的HSCs 的小鼠更快的发育成恶性淋巴瘤（约51 天），而移植了仅含有Myc 的HSCs 的小鼠需要3-6 个月。并且，过表达Myc 和其他单个的96无关的miRNAs 或者单个的mir-17-19-b1 基因簇成员并不能加速肿瘤发生。过量表达Myc和mir-17-19-b1 基因簇miRNAs 的淋巴癌与仅有Myc 过量表达肿
33、瘤相比较，具有更强的增殖能力，更低的细胞死亡率。这些实验证实，mir-17-19-b1 中的miRNAs 可以协同地行使癌基因的功能，可能是由于其靶基因是在MYC 过表达条件下激活的凋亡因子。当凋亡途径被去除，MYC 可以诱导细胞不受控制地增殖，这导致了肿瘤发生。mir-17-92 基因簇的癌基因的功能也在其他肿瘤病例中得到证实，miR-19a 和miR-92-1 的表达水平在B 细胞CLL 病人的肿瘤细胞中上调，mir-17-92 基因簇中的miRNAs 在肺癌中过表达，C13orf25 在腺泡状横纹肌肉瘤和脂肪肉瘤也有扩增。ODonnell 等人单独证明了mir-17-92 基因簇是一组可
34、能的肿瘤相关的基因。他们利用含有235 个人类、小鼠、大鼠的miRNAs 芯片筛选在过表达MYC 的人的B 细胞系P493-6中表达发生变化的miRNA。他们发现MYC 诱导了mir-17-92 的表达，染色体免疫共沉淀实验表明，MYC 结合于C13orf25 第一个内含子区域，这说明MYC 直接调节了mir-17-92pri-miRNA 的转录。下一步需要鉴定受MYC 调节的这个基因簇的靶基因。以前的生物信息学研究表明，转录因子E2F1 是这个miRNA 基因簇中两个miRNAs（miR-17-5p 和miR-20a）的靶基因。E2F1 通过调节DNA 复制、细胞分裂、凋亡相关的基因控制了细
35、胞从G1 期到S期的转换。有趣的是，E2F1 可以正反馈调节MYC。ODonnell 等人还发现，在一株子宫癌细胞株中抑制mir-17-5p 和mir-20a 可以显著的提高E2F1 的表达，并且这一过程并不影响mRNA的含量，这是miRNA 介导的基因抑制的特点。相对野生型的E2F1 3UTR 报告基因载体而言，对于E2F1 3UTR 的miR-17-5p 和miR-20a 互补位点的突变可以导致报告基因的活性增加。综合起来考虑，这些研究说明MYC 可以诱导E2F1 和mir-17-92 的转录。而这些miRNAs 可以抑制E2F1 的翻译。因此，MYC 对于细胞生长的调节是通过mir-17
36、-92 基因簇严格控制的。在MYC 存在的情况下，mir-17-92 基因簇中的miRNAs 限制了E2F1 的活性，通过阻断MYC 和E2F1 的正反馈循环削弱了MYC 对于细胞增殖的影响。在这一模型中，mir-17-92 基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与上面讨论的He 等人的发现是相反的。与这一模型一致的是，ODonnell 和同事还发现，在肝癌中也有编码mir-17-92 的13q31 位点的丢失。然而，尽管E2F1 可以促进细胞增殖，但是当E2F1 的表达水平超过一阈值，它也可以引起凋亡。在此情况下，miRNAs 对于E2F1 的负调控可能是通过阻断E2F1 的诱导凋亡活性，促进
37、MYC 介导的细胞增殖，支持了He 等提出的模型。mir-17-92 基因簇的抑癌基因和癌基因的多重特点表明了肿瘤发生的复杂性和miRNAs调控基因表达的复杂性。这些结果也反映出单个的miRNA可以控制许多不相关的靶基因，导致其可以控制细胞增殖、细胞分化之类相反细胞活动。mir-17-92 基因簇起抑癌基因和癌基因的作用可能依赖于表达这些基因的细胞类型和组织，还与受到调控的特定靶基因有关。未来的研究可能发现，miRNAs调控多个肿瘤相关基因如BCL2，Ras和E2F1。实际上，Felli等人最近发现，miR-221 和miR-222 通过下调KIT癌基因来调节CD34+ HPCs生成红细胞并且
38、抑制TF-1 细胞系的生长。He等人在原发性甲状腺癌中发现KIT转录产物和蛋白水平的减少，miR-221，miR-222，和miR-146 的表达增加，这也暗示着在这些环境中，这些miRNAs具有癌基因的作用。在10 个原发性甲状腺癌病人中有5 个在KIT与miR-221、miR-222 和miR-146 互补的位点有点突变，这导致了miRNAs与靶基因的相互作用的改变。对于这些miRNAs如何通过下调KIT癌基因促进肿瘤发生需要作进一步的研究。因此，miRNAs可能用作多种肿瘤治疗的药物靶点。miRNA 表达谱可能帮助肿瘤诊断Northern-blot 和芯片可以用来确定组织特异性的miRN
39、As 表达。在特定的器官中观察到的独特的miRNA 表达谱证明了发育过程中miRNAs 在干细胞的维持和引导细胞分化中的重要作用。研究人员现在开始使用miRNA 表达特征来对肿瘤进行分类，并且确定那些可以用来估计预后的miRNA 标记。Lu 等人研究发现，相对较少的miRNAs（约200 个）表达谱就可以对人类癌症进行分类。他们设计了一种基于微珠的流式细胞技术的新方法来研究正常和癌症的miRNAs 的表达。多种组织来源的肿瘤通过miRNA 表达谱进行归类，最终发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源的如直肠、肝、胰腺、胃癌被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。有趣的是，利用大约1
40、6000 编码蛋白的mRNA 表达谱对同一批样品进行分类，分级聚类分析却不能得到一致的结果，例如，胃肠来源的肿瘤不能被分到一类中。因此，肿瘤的miRNA 表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs 指导组织特异性发育功能相一致。研究人员还比较了正常组织和肿瘤样品的miRNA 表达谱，发现217 个miRNAs 中的129 个表达水平在肿瘤中下降，这与组织无关。因此，整体来讲，miRNAs 可能与细胞进入分化程度更高的阶段有关，肿瘤和正常组织的miRNA 表达谱差异代表了这些细胞的分化水平的差异。这些研究确定了miRNAs 为“oncomirs”，暗示异常的miRNA
41、表达可能导致去分化，引起肿瘤发生。一个确定多种肿瘤的miRNA 表达谱特征库，可以帮助诊断和治疗肿瘤。由于miRNAs可以从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA 表达谱特征库建立成为可能。某些特定的miRNAs 表达差异已经被证明可以用于精确的预测病人的预后。从治疗的角度，miRNA 表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。例如，Lu等发现，miRNA 特征可以成功地对于组织学上难以诊断的癌症样品进行分类。未来使用miRNA 作为治疗手段miRNAs 具有重要的肿瘤抑制基因的功能，可能会对肿瘤的基因治疗产生很大的影响。类似于上面比较肿瘤和正常组织的miRNA
42、 水平的方式，进行大范围的miRNA 表达扫描，可以鉴定肿瘤有关的新的miRNA。Cheng 等设计实验对miRNA 进行功能扫描，确定那些特异性的控制细胞增殖、凋亡的miRNA 基因。未来，引入与具有癌基因特性的miRNA 互补的合成的反义寡聚核苷酸——抗miRNA 寡聚核苷酸（AMOs）——可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs，延缓其生长。临床上，可以通过经常的或者持续的2-O-甲基化或者锁核酸（LNA）等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA 失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。使用antagomirs（与胆固醇偶联的AM
43、Os），注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA 活性，因而可能成为一种有希望的治疗药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7 家族也可以用于治疗某些特定的肿瘤。利用病毒或者脂质体的表达系统可以瞬时引入大量miRNAs。这些技术可以保证在某些组织特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA 及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA 加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。然而，利用这种类似于用于肿瘤治疗的siRNAs 方法，免疫反应可能会限制RNA 的有效运送。miRNA 治疗从实验室到临床应用的过程中，还需要进一步的发展这些方法。miRNAs 是否能够成为神奇的子弹仍然需要时间的考验，但是，这一领域的研究毫无疑问将会增进人们对肿瘤发生机制的了解。
