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1、Micro RNA在基因表达调控中的作用,一.怎样定义miRNA(成熟),1,长度为22nt的转录体.可通过northern blot等方法检测得到.2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分.3,通过Dicer酶的处理后生成.4,序列具有高度的保守性.,二.miRNA的生成过程,注意事项:1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征 2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟 miRNA的信息.,3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加.4,miRNA可来源于
2、外显子,也可来源于内含子和非编码序列.,5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共表达,三.miRNA的作用机制及功能 作用机制:与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的 翻译.此外,miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列结合调节靶基因的表达.有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他部位结合,升高mRNA的稳定性.注意事项:1,由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实miRNA的靶基因成为一难点.2,一种miRNA常有多个靶基因.功能:miRNA主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA的作用遍及生命
3、体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。Lewis等人的预测结果发现，预测的miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然miRNA的作用也是特异的，特别是5端的28个碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与siRNA不同的是miRNA的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因,6.对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用.比如:在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均可减轻细胞凋亡.7.不同miRNA可同时调节同一靶mRNA,1.miRNA与细胞增殖,apoptosis
4、,抑制cytokine signaling,2.miRNA与细胞凋亡,3.miRNA与细胞信号传导,四.microRNA表达的特点,1,时间特异性,在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同的.,2,组织特异性,在不同的组织中,microRNA的表达不同的,四.寻找miRNA基因,1.Forward genetics,2.MiRNA cloning,3.Computational approaches to miRNA discovery,五.检测miRNA表达的方法 1,Northern杂交 2,Real-time RT-PCR,3.基因芯片的方法,六怎样预测miRNA的靶
5、基因,第一种方法:过表达或抑制miRNA的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因.注意事项:1.并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因.许多差异基因表达的改变是由靶基因表达的改变而引起.,miRNA,转录因子p53,P53的靶基因,P53的靶基因不是该miRNA的靶基因,2.该方法不能证实miRNA所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA 3UTR的配对程度不同,miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不降解靶基因mRNA(配对程度低)但抑制mRNA的翻译,第二种方法:由生物信息学预测miRNA的靶基因.预测miRNA靶基因的网
6、站:http:/.http:/,注意事项:根据背景知识,选择两个或两个以上网站均有预测的靶基因做进一步分析,七怎样证实miRNA的靶基因,5UTR,3UTR,ORF,AAAAAAAAA,靶基因mRNA,PCR扩增3UTR,克隆3UTR到报告基因luciferase下游,luciferase,3UTR,报告载体,将重组载体转染细胞,观察过表达或抑制miRNA后,luciferase活性是否改变.,为进一步证实miRNA确实调节该靶基因,还需完成以下实验,1,突变3UTR 上与miRNA结合序列(主要是种子序列),观察突变后的3UTR 可否废除miRNA对luciferase活性的影响,2,观察过
7、表达或抑制miRNA后,内源性靶基因mRNA和蛋白质水平是否相应改变.,3,miRNA与靶基因功能相关性的研究,八.miRNA表达调控与肿瘤miRNA在基因组DNA上拷贝数的改变(扩增,转位和缺失)比如:(1)在B-CLL中,miR-15a/16-1族区域DNA出现缺失.(2)在淋巴瘤细胞中,miR-17-92族区域DNA出现扩增.在胶质细胞瘤中,miR-26a出现扩增(3)在T-ALL中,miR-17-92出现转位.2.miRNA合成的影响3.miRNA的转录调控(1)转录因子对miRNA的调节作用.(2)DNA甲基化对miRNA的调节作用.比如:miR-136,-431,-432,-433.(3)表观遗传对miRNA的调节作用.,4.miRNA与肿瘤的转移比如:miR-10b,miR-9,miR-31 and miR-335与乳腺癌的转移有关5.miRNA与肿瘤的诊断,谢谢大家!,
