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1、流式细胞术及其应用,第 一 部 分流式细胞术的一般介绍,概念,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM或 FACS）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,FACSCalibur,特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光
2、细胞分选速度慢，主要用于细胞分析,临床型（台式机）,BD LSR,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选,FACSAria,科研型,特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析,流式细胞仪检测范围,细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体,细胞功能,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27
3、分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究,流式细胞仪的工作原理,光学系统 激光光源 光收集系统液流系统 流动室 液流驱动系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统,激光光源,单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，48
4、8nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,细胞分选系统,信号检测-散色光,FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC(90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化,全血细胞流式FSC-SSC图,它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分,信号检测-荧光信号,数据显示类型,单参数直方图（Histogram）,X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,二维等高图和密度图,便于数
5、据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式,光谱交叉,两色以上荧光分析存在 光谱交叉,荧光补偿方法,所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿,抗体使用原则,根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞 悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续培养,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源
6、的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488m,氦氖离子气体激光管发射光波长633m）。488m激光光源常用的荧光染料及他们的激发光和发射光波长分别是：激发光波长 发射光峰值（m）（m）FITC（异硫氰酸荧光素）488525（绿）PE（藻红蛋白）488575（橙红）PI（碘化丙啶）488 630（橙红）ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)488610（红）CY5（化青素）488 675（深红）PreCP(叶绿素蛋白)488675（深红）,第 二 部 分流式细胞术在不同领域的应用,细 胞 周 期 分 析,在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化。正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go
7、),G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。,样品制备,1000rpm 5分钟收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5 PBS悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分钟 离心,
8、两次,混匀，室温静止5分钟,上机,建立获取模式，获取数据（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）,去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用,数据分析,圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡,圈门去除粘连体，分析细胞周期,细胞凋亡分析,细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。,2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光（FSC）与细胞的大小有关，侧散射光（SSC）反映的是光在细胞内的折射作用，与
9、细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。,Annexin V-PE/7-AAD双染色法,双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞,人外周血淋巴细胞亚群检测,结束语,流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。,
