《色层分析法》课件.ppt

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1、2023/5/31,1,第三章 色层分析法,2023/5/31,2,色层分析法提纲,吸附层析分配层析亲和层析凝胶层析实验技术,2023/5/31,3,概述,色层分析法最早始于1900年。1931年,R.Kuhn 等人分离复杂的有机混合物1941年,分配层析概念以及液-液分配层析的塔板理论。1944年,纸层析。50年代开始,出现了气相层析、液相层析、高效液相层析、薄层层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等,层析法和其它技术的联用。,茨维特的实验,石油醚,碳酸钙,2023/5/31,5,色层分析法是由流动相，带着被分离的物质流经固定相，在移动过程中，各种溶质受到固定相不同程度的作用，从而使试样中

2、的各种组分分离。,2023/5/31,6,柱层析：固定相装填在管中成柱形，在柱中进行的层析分离；纸层析：利用滤纸作为固定相的层析分离；薄层层析：固定相在玻璃板、铝膜等支持物上铺成薄层的层析分离。,按固定相的装填方式分类,2023/5/31,7,根据分离的原理分类,2023/5/31,8,一吸附层析（adsorption chromatography）,1.原理2.吸附剂的类型及其选择3.流动相及其选择,2023/5/31,9,吸附指在固体或液体内部或表面的选择性传递。被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。,图15.1,2023/5/31,10,吸附层析 混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定

3、相时在固定相和流动相作用下发生吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过程。,2023/5/31,11,1原理,吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的吸附、脱附作用而实现分离的，这种吸附作用是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层或多分子层。包括几种作用力，被分离样品与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶极分子之间定向力及范德华力等。,2023/5/31,12,吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系曲线。吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表示溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动相中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度,2023/5/31,

4、13,线形的吸附等温线非线形的吸附等温线,2023/5/31,14,2吸附剂的选择,高选择性以实现很好分离；高容量以减少吸附剂的使用量；对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性；具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性；具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀；易于充填或铺层；不会与欲分离试样和流动剂发生化学反应；抗污染性强；价格便宜。,2023/5/31,15,吸附剂的多孔结构，粒度和粒子形状是影响色层系统特性的基本因素。,2023/5/31,16,几种常用的固体吸附剂,2023/5/31,17,活化吸附剂一般可分为极性和非极性两类。极性吸附剂包括氧化物、氢氧化物和盐，在吸附过程中

5、，离子与偶极、偶极与偶极的相互作用起主导作用。非极性吸附剂如活性碳，硅胶等，吸附作用主要是色散力作用的结果。影响吸附剂性质因素：化学结构、吸附剂的溶剂化作用以及吸附剂的预处理、吸附剂的物理状态,2023/5/31,18,在选择吸附剂时，一般是根据吸附剂和被吸附物质理化性质进行的。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质、非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，分离弱极性的组分选用极性强的吸附剂，分离极性较强的组分应选用极性小的吸附剂。,常用的吸附剂有Al2O3，硅胶，羟基磷灰石，聚酰胺等。,2023/5/31,19,（1）硅胶,硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂,2023/5/31,2

6、0,活化：在加热min活化 不同形式（H/G/F）粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物）硅胶具有微酸性，可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体激素、类脂，萜类及色素等物质，硅胶用量一般是样品量的 倍。,2023/5/31,21,（2）氧化铝,Al2O3是由Al(OH)脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al，由于羟基的键作用而能吸附其它物质。l2O3可分为中性、酸性、碱性三种。中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及对酸稳定的中性物质的分离；碱

7、 性l2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中性和碱性物质。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可 用中性的氧化铝分离。一般l2O3用量为样品量的5倍。,2023/5/31,22,2023/5/31,23,（3）羟基磷灰石,化学式Ca5(PO4)3OH2，简称HA。国外的BioRad公司生产的HA有三种规格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量高，稳定性好（在T85，PH5.510.0均可使用）。HA的Ca2基团和生物表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，起着次要的作用。,2023/5/31

8、,24,在使用HA作为固定相基质时，有几点应注意：,i)HA系干粉末时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度（水化后所占有的体积）达到23mL/g后，再按1:6体积加入缓冲液（如0.01mol/L NaP(磷酸钠缓冲溶液)，PH6.8）悬浮，以除去细小颗粒。ii)HA悬浮液须用漩涡振荡器混合，若用磁棒或玻璃棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。,2023/5/31,25,iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。iv)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗

9、的大；从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。但是用细的颗粒层析时，柱子直径大些才能达到满意的流速。参考书：生物化学技术原理及其应用 P45P46,2023/5/31,26,（4）聚酰胺,由己内酰胺聚合而成，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。聚酰胺分子内存在着很多的酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而对这些物质有吸附作用。各种化合物因其与聚酰胺形成氢键能力的不同，吸附能力也就不同，因此可以得到分离。,2023/5/31,27,一般讲来，具有以下规律：能形成氢键基团较多的溶质，其吸附能力较大；对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附能力增大，邻

10、位的使吸附能力减少；芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大；能形成分子内氢键者，吸附能力减少。,2023/5/31,28,（5）吸附树脂,吸附树脂是由人工合成的具有大孔结构和大表面积的吸附剂，可在150以下使用，不溶于溶剂及酸碱。它在使用过程中膨胀或收缩都很小，在重复多次后性能仍然稳定。吸附树脂是一种亲脂性物质，由于其表面性质不同，可吸附溶液中的不同有机物，它的作用力主要是范德华力，这种结合力比起静电引力来要弱得多，所以说从吸附树脂上把被吸附物解吸下来是比较容易的，只要改变其亲水-疏水平衡即可。,2023/5/31,29,2023/5/31,30,2023/5/31,31,吸附树脂在中药提取分

11、离中的发展和应用,中药提取液通过吸附树脂吸附上有效成分的树脂 洗脱洗脱液回收溶液药液干燥半成品 由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开,2023/5/31,32,吸附树脂吸附作用的影响因素,树脂本身化学结构溶剂被吸附的化合物的结构洗脱液,2023/5/31,33,树脂的前处理,市售的树脂常含有未聚合的单体、致孔剂、分散剂等，使用前需除去其中可能有毒性的有机残留物。前处理工艺合格的指标：醇洗脱液加水不显浑浊；洗脱液蒸干后无残留物。建议标准：不挥发性有机残留物的检查可参照美联邦条例第170-199部分3卷21条（1998年修订）；参照日本药

12、典对塑料容器质量控制的有关指标（电导率、易氧化物、酸洗脱液、荧光及紫外吸收）。,2023/5/31,34,吸附树脂的安全性,化学稳定性交联三维网状结构机械稳定性生物稳定性有机残留物总量小于ppm,2023/5/31,35,用于中药成份的提取精制,公开发表的用树脂纯化的成分近种；对生物碱、黄酮、皂苷及其它具有一定极性的成分吸附性较好，对糖类的吸附能力较差。复方的纯化中可能要考虑不同吸附性能树脂的组合来分别吸附纯化不同的有效成分。在中药质量控制与分析中应用。,2023/5/31,36,2023/5/31,37,2023/5/31,38,新型吸附树脂的开发氢键型吸附树脂,依靠与被吸附物质之间形成氢键

13、而实现选择性分离ADS-17，它能与黄酮类、多元酚类形成氢键。ADS-21树脂氢键型极性吸附树脂，酰胺基聚苯乙烯结构可与酚、多元酚、取代酚类和黄酮类化合物的羟基形成氢键。对含有酸性酚羟基的化合物在酸性和弱碱性条件下均能保持良好的吸附性能。ADS-F8树脂凝胶氢键型极性吸附树脂，对黄酮类、多元酚类有较高的吸附选择性。,2023/5/31,39,2023/5/31,40,不同吸附树脂对GBE的分离效果,2023/5/31,41,用吸附树脂制备的黄酮类提取物,2023/5/31,42,离子-偶极型吸附树脂,具有疏水性和离子偶极作用的双功能吸附树脂。ADS-7，它为聚苯乙烯结构、强极性吸附树脂，用于吸

14、附皂甙或其它甙类。特点是兼具吸附和脱色两种功能。,2023/5/31,43,不同树脂对穿心莲内酯的提取效果,2023/5/31,44,用于色层分离的选择性吸附树脂,基于“强吸附弱吸附”的差别，以适当的流动相使混合物中不同的成分先后流出树脂柱外，得到纯的单一物质。,2023/5/31,45,用于非水体系的吸附树脂,用于水难溶或不溶的中药成份的吸附分离。ADS-13从氯仿溶液中吸附分离长春碱，作用原理是形成氢键的作用。ADS-7从有机溶剂中吸附脂溶性的黄酮和多元酚类物质，作用原理是离子偶极作用。ADS-M从有机溶剂中吸附生物碱类，作用原理是络合作用。,2023/5/31,46,分子筛吸附树脂,除去

15、分子量较小的杂质，提高分子量较大的有效成分的含量。除去中药提取物中的农药残留。,2023/5/31,47,展望,树脂吸附技术优点缩小剂量，提高中药内在质量和制剂水平减小产品的吸潮性树脂吸附技术能缩短生产周期,所需设备简单,明确纯化的目的，采用树脂纯化的必要性和方法的合理性，尤其是复方混合提取的上柱纯化。解决实际应用问题。建立树脂的药用标准。,2023/5/31,48,3流动相及其选择,流动相一般指洗脱吸附柱的溶液,它需要满足以下要求:稳定性好,粘度小（0.40.5）10-3Pas,易于分离,易于洗脱所分离组分。,2023/5/31,49,流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争

16、占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的组分容易被吸附剂所吸附，应选用极性较强的流动相才能把它从吸附剂上洗脱下来，使之沿着层析柱前进；弱极性的组分则应选用弱极性的流动相洗脱之。,2023/5/31,50,以聚酰胺为吸附剂时,一般用水作流动相。以吸附树脂为吸附剂时，由于分子间吸附力较弱，可用低级醇、酮或其水溶液洗脱。原则：弱酸性物质在酸性下吸附，碱性下洗脱；弱碱性物质在碱性下吸附，酸性下洗脱。在高浓度盐溶液中进行吸附常用水解吸。常用的流动相按其极性增强顺序排列为:石油醚 环己烷 二硫化碳 四氯化碳 苯 甲苯氯仿乙醚乙酸乙脂丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸。在实践中一般从极性小到极性大溶剂，通过实验来选择。

17、,2023/5/31,51,表1 各种溶剂的介电常数（*20，其他25）,2023/5/31,52,在选择洗脱剂时,还可以由各种溶剂按不同配比配成混合溶剂作为流动相；因此流动相的种类很多，流动相的选择也就比固定相的选择更为复杂。为了获得物质的最佳分离，尤其是极性相差大的物质，应采用洗脱能力递增的流动相。在实践中一般从极性小到极性大溶剂，通过实验来选择。,2023/5/31,53,二分配层析,1.原理2.固定相及其选择3.流动相及其选择,2023/5/31,54,在一个有两相存在的系统中，利用不同物质的分配系数不同而使其分离的方法。在层析分离过程中，这两种互不混溶的溶剂之一为流动相；另一种是吸收

18、在载体中的溶剂，这种溶剂是键合在载体中，在层析过程不流动为固定相。,例如：以硅胶为支持物，硅胶上键合水为固定相，氯仿为流动相分离氨基酸就是一个典型的分配层析实验。,2023/5/31,55,1原理,分配层析是根据欲分离组分在两种互不混溶（或部分混溶）溶剂间溶解度的差异来实现的，当流动相带着试样中的各种组分沿着层析方向流动时，试样中的各种组分就在流动相和固定相两种溶剂间进行分配，不同的组分分配系数有差异时，它们前进的速度就不相同，于是得以分离。,2023/5/31,56,分配层析中的分配系数以Kd表示之。Vs、Vm分别为固定相和流动相的体积，Cs、Cm为溶质在两相中的浓度。于是：,2023/5/

19、31,57,2固定相及其选择,分配层析固定相是通过吸附或键合作用于载体上。常用的载体应符合以下要求：具有多孔结构，能保留较多的固定相，并且吸附或键合固定相能力较强，以防在洗脱过程中被流动相带走。载体有良好的化学惰性。良好的物理化学惰性。价格低廉，使用方便。,2023/5/31,58,分配层析中常用的载体有如下几种：,硅胶：在分配层析中用作载体的硅胶一般在80左右活化，使其表面残留一定量的水分作固定相。纤维素：层析用纤维素可分为两种，即天然纤维素和微晶纤维素。前者是由质量较好的纸浆，经干燥、粉碎后制得，纤维长约2-20um，平均聚合程度为400-500；微晶纤维素是由棉花等较纯的纤维素，加强酸一

20、起加热，部分水解后形成的微小晶体纤维素，平均聚合程度为40200。纤维素上有许多羟基，易与水形成氢键而将水吸附，这种吸附着的水分形成分配柱层析中的固定相。,2023/5/31,59,3流动相及其选择,分配柱层析中的流动相一般是与水不相混溶的有机溶剂如正丁醇、正戊醇等。为了防止层析过程中流动相把吸附于担体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和;为了防止某些被分离组分的离解，流动相应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱。,2023/5/31,60,选择各组分溶解度相差大的溶剂正相层析（固定相极性大于流动相极性）水溶性样品，极性固定相，非极性展开剂反相层析（固定相极性小于流动相极性）亲脂性样品，非极性固定相，

21、极性展开剂,分配层析展开剂选择,2023/5/31,61,2023/5/31,62,三亲和层析,1.原理2.亲和吸附剂的选择3.流动相及其选择 4.亲和吸附剂中“手臂”5.亲合层析实验技术,2023/5/31,63,亲和层析又称为功能层析。这种层析是利用底物，抗体和抗原等之间的特异性亲和力来选择分离的。生物大分子具有与其相应的专一分子可逆结合的特性，即在一定条件下某些物质只能与某一种生物大分子物质结合而不与其他生物大分子结合，当条件改变时如溶液pH或离子强度改变他们又解离。,酶与底物、酶与抑制剂、酶与变构效应剂、酶与辅酶、激素与细胞受体、维生素与结合蛋白、基因与核酸、抗体和抗原、外源凝聚素与红

22、学球表面上的抗原等等，都具有这种特异亲合的关系。,2023/5/31,64,2023/5/31,65,E0表示初始浓度。L0表示固定化配体的初始浓度E表示游离的生物大分子的浓度。,KL表示生物大分子和配体亲和力的大小，L0的数值越大，形成的EL就越多。KL的值大，生物大分子对其配体的亲和力小，反之，则生物大分子对其配体的亲和力就大。,E表示待分离的生物大分子，L表示配体，EL代表配体复合物EL的解离常数KL为：,2023/5/31,66,在亲和层析中，一般都尽可能地提高固定化配体的浓度，对于亲和力较低的体系更加如此。但是在下列两种情况下，高的固定化配体是不适宜的：体系的亲和力特别高，以至于不用

23、强烈的洗脱条件便不能将吸附的大分子洗脱下来。如果配体本身带有电荷，则不能用高浓度固定化配体的载体进行亲和层析。因为，固定化配体浓度高，载体单位面积上固定化配体的密度就大，和其它杂蛋白之间同时形成的离子键的数目也就多，这种离子交换作用造成的非专一性吸附也就强烈。,2023/5/31,67,2亲和吸附剂的选择,（1）配体的选择（2）基质的选择,2023/5/31,68,作为亲和层析的配体须具备3个条件：,在一定的条件下，与纯化的物质进行专一性结合而且具有较强的亲和力。配体和生物大分子结合后,在一定的条件下又能解离,而且无损于生物大分子活性。配体具有与基质连接的化学基团。,1）配体的选择,2023/

24、5/31,69,不溶于水又具有高度的亲水性；化学惰性,极低的非特异性吸附,如物理吸附,离子交换等；有较好的物理和化学的稳定性；具有足够数量的化学基团,经化学方法活化后,易和配体结合；具有稀松的多孔网状结构。,（2）基质的选择,2023/5/31,70,琼脂糖凝胶,一种直链多糖，凝胶态的琼脂糖链呈平行螺旋状，中间由氢键维系，这些多糖链纵横交错，成了多孔网状结构，商品名为Sepharose或Bio-gelA，用2，3-二溴丙醇交联的琼脂糖凝胶，其商品名称为Sepharose CL。由于琼脂糖链间没有共价交联，因此它在逆境中很不稳定，使用温度一般在040之间，pH范围在49之间，而且一般加抗菌剂湿态

25、保存。,2023/5/31,71,聚丙烯酰胺凝胶,由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基酸丙烯酰胺聚合而成的，其商品名为Bio-gel P,P后的不同数字表示排阻限度，如Bio-gel P-100表示允许进入凝胶颗粒内部的球蛋白或肽的最大分子量为1001000=105。聚丙烯酰胺凝胶呈干粉状，加水后溶胀，其结构较紧密，孔小，有些大分子不易渗入。其使用的pH范围是210。,2023/5/31,72,葡聚糖凝胶,由右旋糖苷经环氧氯丙烷交联而成的珠状凝胶，商品名为Sephadex。它是一种小网孔型凝胶，而且与配体结合后多孔性大大降低。,2023/5/31,73,纤维素,由葡萄糖残基组成的链状化合物，但

26、商品纤维素具有不可忽略的吸附性，且结构不均一，限制了其在亲和层析中的应用。,2023/5/31,74,多孔玻璃珠,一种硼硅酸钠玻璃经高温，酸和碱处理制备的控制孔径的玻璃，常用CPG表示。多孔玻璃作为无机载体具有稳定性高的优点，不同CPG的孔径大小适用于从酶和病毒直到完整的细胞。但是表面带的电荷常会引起非专一吸附。,2023/5/31,75,3亲和吸附剂的制备,配体与基质偶联才能成为亲和吸附剂，不同基质与配体采用不同的方法，但其制备过程分步进行：（1）基质的活化；（2）让配体与活化的基质进行偶联反应，形成共价键，从而使配体接到基质上。,2023/5/31,76,（1）多糖类基质的溴化氰活化与偶联

27、,溴化氰活化法,2023/5/31,77,（2）环氧乙烷法活化与偶联,2023/5/31,78,（3）聚丙稀酰胺凝胶,碱催化，产生一个羧基，在碳二亚胺作用下，与具有氨基的化合物偶联。生成酰肼的衍生物，再经过酰化，烷化或在亚硝酸作用下生成酰基叠氮的衍生物，从而与另一个化合物偶联。生成氨乙类的衍生物。,2023/5/31,79,2023/5/31,80,（4）多孔玻璃基质的偶联,2023/5/31,81,（5）基团特异性吸附剂,2023/5/31,82,4亲和吸附剂中“手臂”,2023/5/31,83,为了减少载体的立体障碍，增加配基的活动度，往往在配基与载体之间连接一个具有适当比度的“手臂”。一

28、般采用种方法：（）先将手臂的一端与配体连接，再将手臂的另一端与载体偶联；（）先在载体上按上手臂，再把配基按到手臂上。,2023/5/31,84,2023/5/31,85,柱装好后选用合适的缓冲液平衡柱，所用缓冲液的组成、pH值和离子强度有利于亲合复合物的形成，通常选择中性pH为吸附条件。,2023/5/31,86,层析柱中的配基与被分离物之间以H键、离子间的相互作用或疏水效应相连接，当采用洗脱剂洗脱时，通过削弱他们之间的键力，使被分离物和配基分离，并被洗脱下来。如果待分离的物质与固定配体之间的亲和力较弱，可以连续地用大体积的平衡柱用的缓冲液洗脱。如果配基和生物分子之间的亲和力很高时，改变pH或

29、是离子强度，从而改变配基和生物分子的解离程度，以降低其与固定配体间的亲和力，并从层析柱中洗脱下来。,2023/5/31,87,有时可采用Chaotropic试剂洗脱，即在缓冲液中加入较弱的变性剂，如尿素，胍-盐酸，CCl3-COO-等，变性剂可使生物大分子发生某种程度的变形，减低亲合凝胶上所形成的大分子配基复合物的稳定性，从而有利于大分子物质的洗脱。但是有时亲和吸附存在着较强的非专一吸附，亲和吸附剂不仅能吸附待分离的生物大分子，同时也能吸附一定量的杂蛋白或其它杂质。,2023/5/31,88,欲达到纯化的目的可选择一种和配基亲和力很强的物质加到洗脱缓冲液中洗脱时，该物质及被吸附的大分子物质和配

30、基发生竞争性结合，当洗脱液内物质抢占了配基之后，原来结合在配基上的生物大分子被取代而脱离配基，这种洗脱方式称为专一性洗脱。,2023/5/31,89,亲和吸附剂使用一段时间后，会发生杂蛋白的积累，引起柱子性质的改变，因此层析洗脱之后柱子需要更加充分的洗涤，通常每次层析之后应该用2mol/L的KCl6mol/L尿素洗涤层析柱。为了恢复亲和柱的吸附容量，通常把污染了的亲和吸附剂与非专一性的蛋白酶一起保温过夜，这种方法几乎可以完全恢复柱的吸附容量。通过这样的处理，可大大地延长层析柱的寿命。,2023/5/31,90,四凝胶层析,1.凝胶层析的基本原理2.凝胶层析的基本概念3.凝胶的结构和性质,202

31、3/5/31,91,凝胶层析（Gel Chromatography）又称分子筛层析，凝胶过滤，排阻层析(elusion chromatography)等。凝胶层析是指混合物（如蛋白质）随流动相经固定相（凝胶）的色柱时，混合物中各组份按其分子的大小不同进行分离的技术。,用于凝胶层析的凝胶有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）,琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose）和聚丙稀酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel P）以及交联聚苯乙烯，氧化锌交联的氯丁橡胶等。,2023/5/31,92,1 凝胶层析的基本原理,凝胶是一种具有立体网状结构的物质，凝胶层析的机理是分子筛效应。当含有大小分子的混合物样品加入

32、到色谱柱中。这些物质随洗脱液的流动而移动。大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙随洗脱液移动，最先流出柱外；而小分子可通过凝胶网孔进入粒子内部，然后再扩散出来，流速缓慢，以至最后流出色谱柱。也就是，凝胶层析是按溶质分子量的大小，分别先后流出色谱柱，大分子先流出，小分子后流出。,2023/5/31,93,当两种以上不同分子量的分子均能进入凝胶粒子内部时，则由于它们被排阻和扩散程度不同，在层析柱内所经过的时间和路程长短不同，从而使样品分子大小不同的物质得到分离。,2023/5/31,94,凝胶装柱后，柱床容积（Vt）可分为三个组分，即：Vt=Vo+Vi+Vg Vo 为外容积柱床内凝胶颗粒之间液

33、体的体积，相当于一般层析法中柱内流动相容积；Vi 为内容积，即凝胶颗粒内部所含的液体体积，相当于一般层析法中的固定相容积；Vg 为凝胶颗粒本身的体积。,2023/5/31,95,每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数Kd,则它的洗脱体积Ve为：Ve=Vo+KdVi,2023/5/31,96,Kd可有下列几种情况：,当 Kd=0时，Ve=Vo,即溶质分子完全不能进入凝胶颗粒内，完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外而最先洗脱下来。当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即溶质分子完全渗入凝胶内部，在洗脱过程中将最后流出柱外。当01,即凝胶对组分有吸附作用，此时VeVo+Vi，如苯丙氨在Sephade

34、xG-25中的Kd值为.2。,2023/5/31,97,可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样，两种分子如都能进入内部空隙，即都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。上式中总床体积Vt，可由圆柱形层析柱的体积计算（V=0.25D2h）,而外体积Vo的测定，可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色大分子的溶液通过色谱床，其洗脱体积就等于Vo，最常用的参照物为分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000。Vi可由Wg求得，g为干凝胶重(g)，WR为凝胶的吸水量(ml/g)，或选用一个自由扩

35、散的小分子通过色谱床，此时Kd=1，则Vi=Ve-Vo。,2023/5/31,98,在实际工作中对小分子物质也得不到Kd=1的数值，Vi不易正确测定，故把整个凝胶都作为固定相，则分配系数Kav定义如下：,Ve=Vo+Kav(Vt-Vo),2023/5/31,99,2 凝胶层析的基本概念,（1）得水率（water regain,Wr）1克凝胶吸收水的克数称为得水率。如Sephadex G-100，型号后的数字表示凝胶的得水率乘以10，其得水率为10，即1克G-100干凝胶膨化时能吸收10克水。这个数值只表示吸进凝胶颗粒内部的水分，不包括凝胶颗粒周围的水分。,2023/5/31,100,排阻极限是

36、指不能扩散进入凝胶颗粒网孔内部的最小溶质分子的分子量。如典型的葡聚糖凝胶Sephadex G-75，排阻限度为7*104道尔顿，样品混合物中凡是分子量大于7*104道尔顿的化合物分子在这种凝胶上层析时就得不到有效的分离。,（2）排阻极限（exclusion limit）,2023/5/31,101,使溶质分子在某种凝胶中得到很理想的线性分离的范围就称为这种凝胶的分级分离范围（Fractionation rage）。如Sephadex G-50，分级分离范围为1.5*103-3.0*104道尔顿。,2023/5/31,102,3 凝胶的结构和性质,天然的和人工合成的凝胶种类很多，但是能够用于凝胶

37、层析的种类很少。用于层析的凝胶必须具备下列条件：凝胶是惰性的。凝胶的化学性质是稳定的。凝胶上没有或只有极少量的离子交换基团以避免离子交换效应。凝胶上必须具有足够的机械强度，防止在液流作用下变形。,2023/5/31,103,凝胶层析中，常用的四种凝胶是,葡聚糖（dextramnel）凝胶；聚丙稀酰胺凝胶（polyacrylamine gel）；琼脂糖凝胶（agarose gel）；琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶。,2023/5/31,104,（1）葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶是由葡聚糖与环氧化氯丙烷通过交联反应形成的三维空间的网状结构的高分子化合物。葡聚糖凝胶在水、盐溶液、有机溶液、碱溶液和弱酸溶液中

38、都不溶而性质稳定。强酸溶液中其糖苷键易水解。不能和氧化剂并用，因为氧化剂存在下，易使羟基氧化成羧基而增加离子电荷，从而影响层析特性。层析之后只要防止微生物生长，葡聚糖凝胶可反复使用多次，一般可在100oC煮沸40min消毒。,2023/5/31,105,一般情况下，超细颗粒约400筛目，颗粒直径在1040um之间，用于要求分辨率十分高的柱层析中；细颗粒约100200筛目，直径在50150um之间，用于制备目的；中等和粗颗粒在50100筛目之间，直径约在100300um,则用于低操作压下高流速的制备柱层析。,（1）葡聚糖凝胶,2023/5/31,106,（2）聚丙稀酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶是由丙

39、烯酰胺和交联剂N,N-次甲基双丙烯酰胺共价聚合而成的。商品名称为Bio-Gel P，P后面的阿拉伯数字表示凝胶的排阻极限，单位是1.0*103道尔顿。聚丙烯酰胺凝胶和葡萄糖凝胶在层析性质和吸附性能上极其相似，在pH1-10的缓冲液内，结构和性质均不发生明显的变化。,2023/5/31,107,（3）琼脂糖凝胶,琼脂是海藻制得的天然多聚糖，琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，是由D半乳糖（Dgalactose）和3,6脱水半乳糖(anhydrogalactose)交替构成的多聚糖。琼脂糖制成的这种凝胶，由于分子内和分子间氢键，使得凝胶结构具有较大的稳定性。同时，此凝胶具有很高的排阻极限，适于

40、分离较大的大分子化合物，常用于病毒、核酸及多聚糖的分离分析。,2023/5/31,108,在以水为溶剂的缓冲液、高浓度盐溶液及乙醇中，其结构和性能均不受影响，一般操作温度在0-30。它的商品名因生产厂家不同而异，目前有Sepharose(瑞典的pharmacia公司)2B、4B、6B，阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量；BioGelA(美国的BioRad laboratories公司)有六种型号，即BioGel 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M，阿拉伯数字乘以106表示排阻度；,（3）琼脂糖凝胶,2023/5/31,109,Sagavac(英国)2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C，阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表胶粒状；Gelarose(丹麦)2%，4%，6%，8%，10%，百分数代表干胶量。这类凝胶商品常悬浮于0.01%的叠氮化钠水溶液中。,（3）琼脂糖凝胶,