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1、层 析 法（Chromatography）,层析法,基本原理 层析法的分类 几种常用的层析方法：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析,基 本 概 念,层析法(色谱法、色层分析法、层离法）:通过在固定相和流动相之间的物理和物理化学分配而将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称.,叶绿素,叶绿素,叶黄素，,叶黄素,茨维特色谱图（1906）,基本原理,利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相同，使各组分在支持物上移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。,基本原理,所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是
2、固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶剂。,层析的基本过程,组分A组分B,+流动相,固定相,吸附溶解结合等,解除上述作用,反复进行,移动速度不同,层析法的分类,按两相所处的状态分类,液固层析法,液液层析法,液体,气固层析法,气液层析法,气体,流动相,固体,液体,固定相,层析法的分类,按层析原理分类,各组份在流动相和固定相中的分配系数不同,分配层析法,固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附，对各组分吸附能力不同,吸附层析法,分离原理,名称,固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同,凝胶层析法,固定相是离子交换剂，各组份与离
3、子交换剂形成的盐键数目不同,离子交换层析法,分离原理,名称,续上表,固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离,亲和层析法,分离原理,名称,续上表,层析法的分类,按操作形式不同分类,用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离,纸层析法,固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离,柱层析法,操作形式,名称,将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离,薄膜层析法,几种常用的层析方法,吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析,一、吸附层析（Absorption chromatography）,吸附层析是利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差
4、异进行分离的一种方法，常用于分离易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物。比较常用的是吸附剂氧化铝和硅胶。吸附是可逆的，吸附层析就是吸附与解吸附的矛盾统一过程。,吸附剂和洗脱剂的选择,最大表面积和足够的吸附能力 对欲分离的物质有不同的吸附能力 与溶剂和样品不会发生化学反应 颗粒均匀，不会碎裂,溶剂、洗脱剂：极性大的物质用极性大的洗脱剂,吸附柱层析(Absorption column chromatography),吸附柱层析是利用玻璃柱盛吸附剂。样品溶液加入层析柱，溶质即被吸附剂（固定相）吸附。待样品液全部流入柱内的吸附剂后，再加入适当的洗脱液（流动相），使被吸附的溶质逐步解吸下来，随着洗脱液向下流动
5、而移动，最后被分离。,柱色谱法(Column Chromatograph),机理:吸附层析吸附剂:Al2O3,SiO2(硅胶),聚酰胺等吸附剂和洗脱剂的选择:物质极性 吸附活性 洗脱剂极性 强 小 强 弱 大 弱,装柱,加入样品,层析后,常用洗脱剂极性次序:石油醚环己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇水,柱层析示意图,实验：胡萝卜的柱层析分离法,薄层吸附层析（Thin layer absorption chromatography）,薄层吸附层析是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层，再把样品点在薄层板上，点样的位置靠近板的一端。然后将板的这端浸入适当的溶剂（流动相）中
6、，使溶剂在薄层板上扩散，并在此过程中通过吸附解吸再吸附再解吸的反复进行，而将样品各个组分分离出来。,薄层色谱法点样及展开过程,实验：氨基酸薄层层析,实验、氨基酸薄层层析,二、分配层析（Partition chromatography）,分配层析法是根据物质在两种不相混溶（或部分混溶）的溶剂间溶解度不同，从而有不同的分配来实现分离的方法。属于液液层析。,分配系数（K）,分配层析,分配层析技术大多数是以一种多孔物质作为载体，吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在此载体上而被称为固定相；另一种与固定相互不相溶的非极性溶剂流过固定相，称为流动相。分配层析主要用于分离在水和有机溶剂中都可溶的
7、、极性大的亲水性物质。,固定相滤纸上的吸附水流动相溶剂（乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶 的溶剂）,分离示意图,Rf 0.02，A、B可分离.,与标样比较可定性鉴定,如果两种氨基酸的迁移速率相近，或者氨基酸的Rf值相同，如何来分离？,氨基酸的Rf值,展开剂正丁醇+吡啶+水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24 1:1:1正丁醇+醋酸+水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11 12:3:5,例：氨基酸混合液点在1515cm滤纸边2cm处，风干，展开剂用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），当溶剂移动至14cm处，取出风干。（第一次展开）,将滤纸折成筒状
8、，使斑点处于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺(10:10:5:1)展开至14cm，取出风干。(第二次展开)显色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-冰HAc,第二次展开,实验：氨基酸双向纸色谱法,第一次展开,氨基酸双向纸层析色谱,PC检测方法；颜色,显色(反应显色,I2蒸气,紫外灯照)剪下斑点，用适当的溶剂洗脱后测定(比色,荧光),溶液中的离子与离子交换树脂发生离子交换而分离.,三、离子交换层析（Ion-exchange chromatography）,柱层析,离子交换层析法将交换上去的离子，用适当的洗脱剂依次洗脱而分离.,离子交换层析用于分离氨基酸、核苷、核苷酸等小分子物质比较理想.去离
9、子水的制备？水的净化:阳离子柱阴离子柱混合柱,离子交换分离法的应用,离子交换分离操作技术,树脂的选择和处理装柱交换洗脱树脂再生,离子交换层析,离子交换剂的优点：（1）不溶性的高分子聚合物，具有立体网状结构，有较好的化学稳定性。（2）交换剂本身吸附能力弱，引入的可以发生电离的活性基团。（3）多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。,阳离子交换分离（0.1molL-1 HCl为淋洗液）,亲和力大的先被交换上去,后被洗脱下来.,树脂类型,阳离子交换树脂:含酸性活性基团的树脂。强酸型：RSO3H pH 0-14 不受酸度限制,弱酸型：RCOOH pH4 ROH pH9.5 选择性好,
10、可分离各种有机碱及氨基酸,强碱型：R N(CH3)3Cl pH 0-14弱碱型：R NH2，RNHCH3 pH 0-7 RN(CH3)2 pH 9.5,螯合树脂：含有特殊的螯合活性基团,阴离子交换树脂:含碱性活性基团的树脂,树脂对离子的亲和力顺序,强酸型阳离子交换树脂 对一价阳离子 Li+H+Na+NH4+K+Rb+Cs+Ag+Tl+对二价阳离子 Mg2+Ca2+Sr2+Ba2+Fe2+Co2+Ni2+Cu2+Zn2+水合离子半径越小亲和力越大,强碱型阴离子交换树脂 F-OH-Ac-HCOO-H2PO4-Cl-NO3-HSO4-CrO42-SO42-,对不同价态离子 Na+Ca2+Fe3+Th
11、4+电荷数越高亲和力越大,四、凝胶层析（Gel chromatography）,凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。主要用于大分子物质的分离。,凝胶的种类和性质,交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P),分子筛效应,凝胶层析示意图,凝胶层析,分子筛效应 全排阻：分子直径比凝胶最大孔隙直径大，全部被排阻在凝胶颗粒之外另外，直径比凝胶最小孔隙直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。,凝胶层析的应用,1、分离提纯蛋白质、核酸等生物大分子(脱盐)2、酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素
12、、生物碱等物质的分离精制 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩,层析柱的重要参数,柱体积Vt：凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。Vt=1/4 d2h 外水体积V0：层析柱内凝胶颗粒间隙的总容积。,层析柱的重要参数,内水体积Vi：凝胶颗粒内部微孔的总容积。Vi=W（凝胶干重）Wr（吸水值）凝胶颗粒基质所占的容积Vr 峰洗脱体积Ve：被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积,层析柱的重要参数,分配系数Kd,凝胶层析的实验技术,层析柱(r、h）凝胶的选择 凝胶的准备 样品溶液的处理 防止微生物污染,五、亲和层析（Affinity chromatography）,亲和层析是利用待分离
13、物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。,亲和层析,具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等,举例：mRNA的分离,原理：以总RNA为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过寡聚（dT）纤维素或者寡聚（U）琼脂糖亲合层析从大量的RNA中分离mRNA。,方法：（1）oligo(dT)-纤维素层 析柱法（2）oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法（3）磁珠分离法,oligo(dT)-纤维素层析柱法,磁珠分离法,配体与载
14、体结合（固相化）,装柱（亲和层析柱）,亲和吸附,（生物高分子与配体专一结合）,解吸附,洗柱,亲和层析的基本过程,配体与载体的联接方法,吸附法：配体吸附于固相载体或离子交换剂上共价偶联法：配体通过化学共价键联结于固相载体交联法：依靠双功能试剂造成分子之间交联，聚集成网状结构。包埋法：配体被包裹于凝胶格子或聚合物的半透膜微胶囊中。,亲和层析的应用,亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。,亲和层析的应用,纯化生物大分子 稀溶液的浓缩 从纯化的分子中除去残余的污染物,层析方法的选择原则,易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物的分离常用吸附层析法，可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离，在水和有机溶剂中都可溶的混合物用分配层析法分离。有特异性配体的物质可用亲和层析大分子的分离可用凝胶层析,Bye Bye!,请你谈谈你对生物化学第二篇物质代谢及其调节学习的体会？对授课老师所讲授的课程有何建议和意见？,
