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1、生猪重要疫病样品采集要求与实验室检测意义,李峰 研究员山东省滨州畜牧兽医研究院山东省生猪创新团队滨州综合试验站,生猪重要疫病实验室检测技术研修班,分享内容,实验室检测的重要意义实验室检测的主要内容生猪主要疫病样品采集要求与注意事项其他样品采集要求,实验室检测的重要意义,明确所发生的疾病种类：传染性因素：细菌、病毒、支原体、其它微生物；非传染性因素 单纯感染/混合感染 是否为人兽共患病,病原分子生物学检测分析区域优势毒株基因型分析病原分子进化与演变病原分子序列与疫苗比对,细菌培养与药物敏感性试验细菌初步鉴定：毒力、血清型药物敏感性试验：解决合理用药问题自家疫苗试制：技术储备,开展抗体检测疫苗免疫
2、抗体监测与评价野毒感染状况调查与评价：PRV、传胸免疫程序调整与优化：母源抗体检测疫病净化评价,猪伪狂犬gE抗体检测情况统计,实验室检测的主要内容,细菌的染色形态学观察培养基的制备细菌分离培养纯化细菌的生化试验药物敏感试验,病猪的剖检,病猪病料的采集、保存,总RNA的提取反转录聚合酶链式反应（PCR）,猪瘟病毒抗体 猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒)猪流感血凝抑制试验 猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT）猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体,DNA提取PCR,血清学检测,分子诊断,细菌分离,结果分析,生猪主要疫病样品采集要求,采样原则,1、适时采集：尽可能采集到新鲜样品。用于分离病原体的，须在病初发热期或出
3、现典型临诊症状时采集；若制备血清，空腹时采血。尸体上采样，应在动物死后立即采集。2、典型采样：样品具有代表性。选择典型动物，即未经药物治疗、病状典型的动物；选择典型材料，病原体含量最高的材料；尸体采样，采集有病变组织、器官或病变最明显、最典型的部位。3、合理采样：群体发病时，至少采5头动物的病料。每一种样品应有足够的数量。4、无菌采样：无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清学检查的样品 5、安全采样：注意人员安全，防止感染，防止病原扩散造成环境污染。,病理剖检,腹部朝上平放,切开四肢,颈部淋巴结,股内则淋巴结,剖检颌、颈部,皮下组织、颌下淋巴结观察,横切胸骨柄，暴露胸腹腔,观察胸腹腔器官变化,纵
4、切胸骨柄,取出胸腔器官,剖开颅腔,暴露脑部,依据剖检病变推导可能发生疫病,依据病种确定主要采集病料,供病原学检查材料的采集、处理,1、血液。前腔静脉或耳静脉采血。2、分泌物和渗出液：采集口腔、鼻腔、喉气管、泄殖腔和阴道分泌物时，通常是将棉棒插入天然孔反复旋转后蘸上分泌物，然后将样品端剪下。3、淋巴结、内脏器官、肌肉：淋巴结连带周围脂肪整体采集；内脏器官和肌肉，通常取病变最明显的部位。4、水疱皮：将病变部位清水清洗，剪取新鲜水疱皮35g放入灭菌小瓶内5、肠管：选取至少6cm肠管，两端结扎，从结扎线外端稍远端剪断。以上病料采集后，立即放入灭菌的玻璃容器，密封，外贴标签。做细菌学检查的，尽快冷藏。做
5、病毒学检查的，尽快冷冻或加入病毒保护液。常用的病毒保护液：含抗生素的磷酸盐缓冲液、50%甘油磷酸盐缓冲液。,供血清学检查材料的采集、处理,（1）采血。用于制备血清的血液采出后不加抗凝剂，不进行脱纤处理。大中动物每头不少于5ml。（2）制备血清。采血时使血液直接流入试管，加塞，立即摆成斜面，待血液凝固后竖起试管，使血清自然析出。也可将血液离心分离血清。作血清学检测的血液，在采集、运送、制备血清过程中，均应避免震动和冻结，防止溶血，影响检测结果。（3）血清保存。制备的血清若能在一周内检测，4冷藏，若需保存较长时间，应于30 冻结。,猪的前腔静脉采血方法,猪只的固定。公母猪用保定绳固定，要求尽可能吊
6、得高一点，使猪的头颈与水平面呈30度以上角度(如图1)，这样，即方便采血人员察看采血部位，又使前腔静脉向外突出，静脉血充胀。20kg以上的中大猪，由1-2个饲养员用捉猪器(或保定绳)拉住，头昂起，偏向右侧(如图2、3)；20kg以下的小猪，可由1-2个饲养员抓起，倒立，后背紧靠在栏架上(如图4)。,图1 公母猪保定,图2 中猪固定和采血,图3 大猪固定和采血,图4 小猪的保定与采血,选取合适的针筒和针头。根据经验，公母猪宜选用16#50mm针头(这种针头猪场不常用，但很多针头生产厂家都有生产，可以找兽医药械销售店联系购买)；30kg以上的中大猪，宜选用12#38mm针头；10-30kg小猪，可
7、选用9#25mm(一次性注射器常配的针头)；10kg以下乳猪，应选择9#20mm针头(一次性注射器所配的另一种规格的针头),找准下针部位。猪的前腔静脉，越往头部越浅，但也越细；越靠胸部越粗，但越深。所以，采血应选择适当的部位。小猪取血的部位太靠前，血管太小，很难扎中，而且扎中了也很难抽到血液，所以，小猪的采血部位应稍靠后。中大猪和公母猪血管比较大，往后太深，针头够不到血管，所以，应略靠前。根据我们的经验，20kg以下的小猪应采两前肢与气管交汇处(如图4)，公母猪和20kg以上中大猪可选颈部最低凹处(如图2、3）。,下针和抽血。小猪：对准以上描述的部位，用针垂直刺入。拉紧针筒活塞，若针头扎中前腔
8、静脉，可见到血液自血管源源流出，抽取所需的血量即可。公母猪和中大猪：对准下针部位，使针头偏向气管约15o方向下针，拉紧针筒活塞，若扎中，可见血液流出。如果见不至血液流出，说明没有扎中，有可能是前腔静脉较深，可用手顶紧针筒，使针头扎深一点。,处理好所采的血液。采到血液后，应立即将注射器内的血液沿着贮藏血液的容器（试管或青霉素空瓶）徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡，同时倾斜放置好。也可放在注射器内倾斜放置好后送检。若要送检血清，夏天在常温下放置一段时间，冬天要放置在2537温水中一段时间，以利血清析出。若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。,耳静脉采血方法,1)将猪站立或横卧保定，或用保
9、定器具保定。2)耳静脉局部按常规消毒处理。3)1人用手指捏压耳根部静脉血管处，使静脉充盈、怒张（或用酒精棉反复局部涂擦以引起其充血）。4)术者用左手把持耳朵，将其托平并使采血部位稍高。5)右手持连接针头的采血器，沿静脉管使针头与皮肤呈300450角，刺入皮肤及血管内，轻轻回抽针芯，如有回血即证明已刺入血管，再将针管放平并沿血管稍向前伸入，抽取血液。,实验室检测策略,以前：,我们的误区,猪群发病了，采发病猪的血，化验。结果：无所适从。结论：化验无用，没有帮助。,缺乏有效的实验室支持，是造成盲目用药、用苗的原因之一,服务承诺,服务口号：快速、高效、及时服务承诺：对于已有检验方法的检验项目，48小时内给出准确检验结果；对于尚无检验方法的项目，5个工作日内给予相关疫病的分子检测检测结果；对使用过我公司研发的试剂盒的客户，第一时间安排专职的研究人员，提供全程技术支持服务；,
