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1、第七节 消化毒剂的作用机理,1996年，吴文君等首次提出了消化毒剂的概念，把主要作用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为消化毒剂。破坏中肠 中肠组织破坏剂 影响消化酶系 消化抑制剂。,主要种类：Bt内毒素 植物源次生代谢物如二氢沉香呋喃类化合物等。,两类靶标,一、Bt内毒素,苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt），产品已达60余种，是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。,基本作用机理 Bt的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体在起作用。杀虫蛋白晶体，也叫原毒素（protoxin），是由多个杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal pr
2、oteins,ICPs）或-内毒素（-endotoxin）或Cry（晶体）蛋白的亚单位组成。昆虫摄食该毒蛋白后，在中肠的高pH环境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解。症状：试虫失去运动能力，不停颤抖，呕吐，停止取食，死亡。,1.Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）,杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)所产生的毒素。毒蛋白主要有7种：-外毒素、-外毒素、-外毒素、-内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。-内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，位于芽孢之
3、旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素(Pretoxin)，经过激活，即消化成分子量为100070000的片段，才起毒素作用。,对-外毒素的深入研究表明，其作用机制主要是抑制依赖DNA的RNA聚合酶，从而抑制了RNA的合成。从这种毒素的作用机理来看，估计对哺乳动物是有害的，因而使用需慎重。现在欧美供实用的苏云金芽泡杆菌制剂是不产生-外毒素的变种，但苏联的制剂中含有-外毒素。,晶体蛋白有130多种，按照杀虫范围和寄主同源型又可分为两大类群，即Cry（广谱性）蛋白和Cyt（双翅目、活体活性低）蛋白，同时还发现一种营养期杀虫蛋白（VIPs），活性与专一性同Cry。
4、Cry分为四大类（根据杀虫谱）：CryI（鳞翅目）；CryII(鳞翅目和双翅目)CryIII（鞘翅目）；CryIV(双翅目)。通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，对有益生物和脊椎动物安全。,1.Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）,完整的毒蛋白一般由三个结构域组成。结构域由一个-螺旋束组成，可能与细胞膜穿 孔有关；结构域由三组-折叠片层组成，可能参与了毒 素与膜受体蛋白的识别和结合；结构域位于毒素分子C-端，可能阻止昆虫肠道蛋 白酶对毒性肽分子的进一步降解。,1.Bt杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）,2.Bt毒素受体蛋白,晶体蛋白的毒性与受体蛋白
5、和晶体蛋白结合的能力呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子。鳞翅目昆虫中肠Bt毒素受体蛋白主要为中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV)的氨肽酶 N(aminopeptidase N，APN)、类钙粘蛋白CLP(cadherin-like)以及碱性磷酸酶。此外鞘糖脂也是一种迄今未知的无脊椎动物Bt毒素的普遍受体。,-内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节。,3.杀虫晶体蛋白的作用机理,毒素的溶解 晶体蛋白可以溶解于pH 12或pH 9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如pH值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响-内毒素在昆虫体内的溶解性。鳞翅目
6、幼虫的中肠pH值一般都较高，呈碱性,对-内毒素的溶解很有利。,3 杀虫晶体蛋白的作用机理,毒素的活化 溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130kD左右的前毒素，打开二硫键，释放出N端的70kD左右的抗酶多肽活力片段。活力片段至少由两部分组成,即毒力片段和细胞结合片段。毒力片段主要结构是-螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效可能起着重要作用。细胞结合片段由C端的保守区和中间的可变区组成，主要结构是-片层，负责毒素与靶标昆虫受体的结合，从而决定了毒素的选择性。中肠酶液的组成直接影响到-内毒素的降解活化,对-内毒素作用的专一性起着重要作用。,3 杀虫晶体蛋白的作用机理,毒蛋白的活化过程,毒素的活化,3 杀
7、虫晶体蛋白的作用机理,3 杀虫晶体蛋白的作用新模型,毒素与受体蛋白的结合 毒素被活化以后首先是通过结构域与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。结合分为两步，第一步与CLP受体的初始结合(Initial Binding)，同时被BBMV上的蛋白酶进一步水解去除大约3Kd的a1螺旋，聚集成四聚体结构；低聚体与APN结合即二次受体结合,在APN 受体的帮助下,毒素低聚体在细胞膜脂质筏区域上聚集,此时的毒素与受体难以发生解离,故为不可逆性结合(Irreversible Binding)。,插入及孔洞或离子通道的形成 与受体结合的低聚体,由APN促使其运动到脂筏,Cry结构域在脂筏区插入膜内,进而诱导
8、孔的形成，导致膜完整性的破，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡。四聚体与毒素单体不同，能够在膜上形成稳定的孔道。这一理论解释了APN作为重要的功能性受体却与单一Cry1A毒素亲和力低的原因。,3 杀虫晶体蛋白的作用新模型,搭载着蛋白质的由鞘脂类和胆固醇动态聚集而成的、相对稳定地具有一定功能漂浮在二维流动的细胞膜中的微区，被形象地称之为“功能筏”（functional rafts）,结构域由6-7个两亲的-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成。其穿孔机制被认为是结构域II在完成毒素-受体识别后，与受体结合的结构域的6个-螺旋像一把撑开的伞将中心的螺旋插向膜结构,同时把结构域也推向膜
9、脂,进而形成通道,导致上皮细胞的K+渗透势和pH梯度被破坏。组织病理学试验显示中肠柱细胞成空泡状,微绒毛损伤,中肠内充满上皮细胞内容物,中肠细胞消亡,最后昆虫幼虫死亡。,结构域在杀虫蛋白中的作用,3 杀虫晶体蛋白的作用新模型,图2 Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图,这个新的模型首次提出了 Cry毒素在昆虫的BBMV上不是只同一个受体相互作用,而是与两个的受体先后发生结合,强调了脂筏在形成孔的过程中的作用,而且解释了APN作为重要的功能性受体却与单一Cry1A毒素亲和力低的原因。这种与几个受体分子先后结合,并通过脂筏插入膜或进入细胞的机制在其它的毒素(如气单胞菌溶素)和病毒(如艾
10、滋病病毒)的致病过程中是普遍存在的。该模型的提出使我们能更完整地解释Bt 的毒性和抗性机制,对其它病原的致病机理研究也有借鉴作用。,3 杀虫晶体蛋白的作用新模型的意义,二氢沉香呋喃类化合物：苦皮藤素、等可致粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落；基膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低；内质网极度扩张，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模糊不清楚，双层膜不完整。推测其机理为：此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。推测其机理为：此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透
11、性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。,二、其他消化毒剂,丁布：可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育，使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸形蛹等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用。丁布是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育。丁布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大量分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而细胞消融。急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且受损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营养物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。,DIMBOA 丁布,2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3-酮,
