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1、22液相色谱技术Chromatography,背景,色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。,色谱法的基本原理,色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、
2、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,慢中等快,色谱分离,22.1色谱的基本概念,固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。,分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd
3、-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。,分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。,两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.,阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小.,洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。,理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板
4、数（N）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。,理论板数的计算方法,N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：,L-柱长,22.2 色谱分离方法的分类,色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：,按操作形式不同分类：柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离
5、和鉴定。纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。,按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱,22.3 各类色谱技术及应用,凝胶过滤色谱离子交换色谱疏水色谱聚焦色谱反相色谱超临界流体色谱羟基磷灰石色谱灌注色谱应用,凝胶过滤技术,1)Gel filtration chromatography(GFC)原理操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散
6、进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。分子筛色谱:从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。,分子筛凝胶色谱原理,分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt,组分1-2在V0-Vt之间.显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离,分配系数m影响因素：分子量,分子形状,gel孔径结构；与pH,I,T无关.,2
7、)凝胶介质对介质的要求：1st亲水性高；2nd表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th具有一定的孔径分布；5th机械强度高，耐高压操作，寿命长。商品化的介质均能满足1-4条的要求。介质的类型：1st Sephadex2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th TSKgel,凝胶介质特征参数排阻极限(exclusion limit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，Sephadex G50的排阻极限为30kD。分级范围(fractionation range)：能阻滞组分并
8、且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如，Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。溶胀率/吸水率：如，Sephadex G50的溶胀率=500 30%。,凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150m之间；硬gel较小，在5-50m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如，Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(blue dextran)测定。,4)影响GFC分离特性的因素
9、线速度：1st HW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m=0，故HETP=2Dz/u(Dz udp)=常数。2nd HW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m 0,HETP u;在u=0处，直线交于点 2Dz/u。3rd 当u 0.2 cm/min,NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。,进样体积：1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；2nd 但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。3rd 意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。料液浓度依据GFC的原理，tr和HETP与浓
10、度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。,分子量M和分配系数m1st 在GFC分级范围内m与M关系此时，分离度方程为方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。2nd 因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。,凝胶的粒径1st dp,HETP.故dp是N的最佳途径；2nd dp10倍,而h和v不变，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍,5）应用1st 分离纯化M：x0-106，d:0.x-x00nm之间；种类：肽、脂质、抗生素
11、、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd 除热原、过敏原如青霉噻唑蛋白 Sephadex G25凝胶柱。3rd脱盐/置换buffer,4th M测定原理：挑选标准蛋白质：cyt C(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500).条件：在凝胶介质分级范围内.作图：,6）优点1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；2nd 溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%；3rd 分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；4th作为脱盐手段，GFC比透析法速
12、度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。7）缺点1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；2nd 经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。,离子交换色谱,以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,原理(ion exchanger chromatography,IEC)1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数mI-离子强度；A和B为常数,均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m-离子强度无限大时的溶质
13、分配系数,为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。2nd 意义：对于pro.和aa调节I value调节|pH pI|value,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高
14、、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,操作1st 恒定洗脱(Sephadex常用)缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽,2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。,3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution),优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度
15、不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。,线性洗脱时间定义：GHdI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s).利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr,分离度和柱效1st 分离度意义：4因素可控制2nd 柱效意义：,I+dII,mi,富集效应,应用：,疏水性吸附色谱(hydrophobic interaction chromatography,HIC),原理1)吸附1st pro疏水性2nd pro稀疏水性差异3rd 原有吸附介质的亲水性4th 亲水性介质的改造,2)影响pro水化层因素1st 水化层(hydration shell)tight hydrat
16、ion shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water/1g pro)2nd ionic strength3rd|pH水 pI|Value|pH水 pI|Value zeta电势 水化层4th 增加亲水性物质离子：SCN-，ClO4-，I-有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质5th 表面活性剂,Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell,洗脱方法?,3)、洗脱方法,降低离子强度,增加|pH pI|,乙二醇 or I-,表面活性剂,4)、富集效应,I+dII,mi,分离
17、效率和柱效1st 分离效率2nd 柱效3rd 降低颗粒大小的极端重要性,Applications,特点：1st互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2nd 与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th 疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。,反相色谱reversed phase chromatography,RPC,固定相：非
18、极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS Octadecyl silica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：有机溶剂增加。,Influence of Particle Size on the Separation effect,Source RPC,应用：主要应用于5000KD以下，特别是1000以下的非极性小分子物质的分离蛋白质：
19、可以应用，但存在变性的危险。,有机溶剂,亲和色谱（Affinity chromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,生物亲和作用和亲和纯化技术,生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术,亲和纯化技术的发展,亲和层析 1951年，Campbell等，半抗原修饰纤维素制备了生物亲和介质从血情中纯化了抗体。1967年，Axen等利用溴化腈活化琼脂糖凝胶成功制备了亲和吸附介质，使亲和层析技术从研究走向实用。其他新型亲和技术：
20、亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀，亲和电泳等,生物亲和作用-本质,亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙-锁关系亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用,亲和作用中的相互作用力,静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键,影响亲和作用的因素,离子强度pH抑制氢键形成的物质温度螯合剂,亲和作用体系,配基（ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。L+EE L解离常数：Kd=EL/EL 结合常数：Ka=1/Kd=EL/EL亲和体系的结合常数为104-108dm3/m
21、ol,亲和层析原理,亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法,亲和层析-操作过程,亲和配基,酶的抑制剂:大豆胰蛋白酶抑制剂抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+组氨酸:咪唑环，静电和疏水作用。肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。
22、,亲和吸附介质,将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度含有可活化的反应基团粒径均一的球形粒子,亲和配基固定化,亲和配基的固定化方法介质的活化,溴化腈活化法：-NH2，在碱性条件下完成。环氧基活化法：-NH2,-OH,-SH直接固定法和间接固定法（氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法）硅胶的活化法:-OH，不宜在碱性条件下进行。,间隔臂的作用,当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱,过程及影响因素,
23、过程：进料清洗洗脱柱子再生。应保证配基对目标产物有较高的吸附容量。目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用Freundlich或Langmuir型的等温式表示。进料过程中的杂质影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。进料的料液流速 流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。,目标产物洗脱,特异性洗脱 洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物,例：精氨酸溶液洗脱赖氨酸为配基亲和吸附的t-PA,目标产物洗脱,非特异性洗脱：调节洗脱液的pH值，离子强度，离子种类或温度等理化
24、性质。,柱子：BSA-Sepharose 4B 洗脱方式：逐次降低洗脱液pH值分离组分：BSA血清不同的抗体组分。,应用举例,组织纤溶酶原激活剂（t-PA）的纯化干扰素（IFN）的纯化 重组人白细胞干扰素，经一步单抗免疫亲和层析，rhIFN-比活提高了1150倍，收率达95%。,柱子：精氨酸-Sepharose 4B亲和柱洗脱液：盐酸胍（GuCl)猪心组织t-PA:活性提高7倍，收率为56%,22.4 蛋白质分离常用的色谱方法,免疫亲和色谱属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和色谱介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上,疏水
25、色谱在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点蛋白质的局部变性洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行,离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）,缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在1020m mol。色谱方案的确定，需要视试验情况作适当调整。
26、洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度,22.5 色谱系统,高通量液相色谱系统,分析型色谱系统,AKTA explorer 100色谱系统,AKTA explorer 100色谱系统工作流程,HPLC,HPLC,AIEX,Technique,Purificationfactor,Q Sepharose FF,10 times purification 82%yield,Phenyl Sepharose HP,HIC,Y.-F.Liao et al.(1996)J.Biol.Chem.271,28348,Purification of recombinant a-mannosidase from Pi
27、chia pastoris,多肽的分离纯化,蛋白的纯化,G Protein Receptor Kinase Purification,Rec a-Mannosidase Purification from Pichia,DNA Binding Protein Purification,思考题,什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理.什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？什么是吸附色谱及其分类和基本原理？什么是分配色谱？简述高效液相色谱的工作原理？,离子交换色谱的分类及应用凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用色谱的原理高效液相色谱的分离原理及应用？共价色谱的工作原理？,
