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1、第六章 连续培养的基本原理,第一节 微生物生长动力学微生物生长动力学是研究微生物生长过程的速率及其影响速率的因素，从而获得相关信息。,一、生长现象与繁殖方式,根据微生物的个体形态、群体形态、生理特征、生化反应等生物学特征，微生物可分为三大类：、非细胞型微生物（病毒）；、原核细胞型微生物，仅有原始细胞核，如细 菌、放线菌等；、真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞 藻类，原生动物。,表1 微生物的生长现象与繁殖方式,放线菌-无性孢子,二、微生物生长的测定,微生物的生长和产物的生成有着密切的关系，因此生长的测定对发酵的控制很重要。微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量
2、或大小。生长测定常用理化方法，分为测定细胞数目和细胞重量两类。,1、计数法,浊度计比浊法 测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长。计数器计数法 在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长。,2、测定细胞重量,细胞干重称量法 直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量。细胞堆积容积测量法（离心压缩细胞体积法）用刻度锥形管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量。细胞组成分析法 测定一种大分子的细胞组成(如蛋白质、RNA、DNA等)，间接算出细胞的重量。,营养物消耗分析法 测定培养基中不用于合成代谢产物的营 养物（磷
3、酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示生长的细胞重量。产物重量分析法 测定培养中间形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接换算出生长的细胞重量。,三、微生物生长动力学,微生物不能调节自身的温度，每种微生物都有它的生长最适温度，以及最适pH、无机盐浓度和糖浓度等。,1、微生物生长曲线,细胞的生长过程可以用细胞浓度的变化来描述和表达。若取细胞浓度的对数值与细胞生长时间对应作图，可得到分批培养时的细胞浓度变化曲线。,在培养成分一定时，微生物的生长一般分五个阶段,迟缓期（适应期）对数生长期减速期静止期（平衡期）衰退期（死亡期）,（1）迟缓期,延迟期系指培养基接种后，细胞浓度在一段时间内无明显增加的这一
4、阶段。它是细胞在环境改变后表现出来的一个适应阶段。如果新培养基中含有较丰富的某种营养物质，而在老环境中则缺乏这种物质，细胞在新环境中就必须合成有关的酶来利用该物质，从而表现出延迟期。,（2）对数生长期,在此阶段中，培养基中营养物质较充分，细胞的生长不受限制，细胞浓度随时间呈指数生长。由于在此阶段，细胞分裂繁殖最为旺盛，生理活性最高。因此在工业微生物反应中，常转接处于指数生长期中期的细胞，以保证转接后细胞能迅速生长，微生物反应能快速进行。,（3）减速期,减速期的存在是由于当细胞大量生长后，培养基中营养物质大量消耗，加上有害代谢物质的积累，细胞的生长速率开始减缓，从而进入减速期。,（4）平衡期,平
5、衡期是由于营养物质已耗尽或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增加。平衡期内的细胞浓度为最大浓度。,（5）衰退期,衰亡期是由于环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度下降，细胞生长速率为负值。,2、微生物生长动力学,微生物生长动力学可反映出细胞适应环境变化的能力。这也是我们学习研究生长动力学的原因。,(1)比生长速率,微生物生长的特点表现为细胞数目或细胞物质（量）增加一倍所需要的时间。如果细胞物质或细胞数增长一倍的时间间隔是常数，则微生物是以指数速度增长，可用数学模型来描述。：比生长速率：比生长速率 X：细胞浓度(g/L)N：每升细胞数,上式表明细胞物质随时间而增加或细胞数目随时间增加而增加。大多数情
6、况下生长是以物质的增加来衡量的，因而符号 得到应用。X 为单位体积生长速率。,若为常数，则：此式可在t=td时求得，td即在X2=2X1时所需时间，于是 td=ln2/=0.693/,对上式积分得：,例5-1 某微生物的0.125 h-1，求td。解：td=ln2/=0.693/0.125=5.544 h,在微生物培养过程中，菌体浓度的生长速率是菌体浓度、基质浓度和抑制剂浓度的函数，即 dx/dt=f(X.S.I)以上两式表明菌体浓度的增长速率与培养液中菌体浓度成正比。,比生长速率的意义：比生长速率就是菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系。在对数生长期，是一个常数，这
7、时,（2）无抑制的细胞生长动力学 Monod方程,现代细胞生长动力学的奠基人Monod在1942年便指出，在培养基中无抑制剂存在的情况下，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：,该方程中 为比生长速率(s-1)；为最大比生长速率(s-1，min-1，h-1)，S为限制性基质浓度(g/L)；Ks为饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度；培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其它组分为过量不影响细胞的生长；细胞的生长视为简单的单
8、一反应，细胞得率为一常数。,细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系,S,当限制性基质浓度很低时，S Ks，此时若提高限制性基质浓度，可以明显提高细胞的生长速率。此时有：细胞比生长速率与基质浓度为一级动力学关系。,当S Ks时，=m，若继续提高基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞的比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。,将Monod方程式变为为直线方程。不同的菌种，不同的培养基，Ks和 是不同的。,Ks和m值随菌种、限制性基质种类的变化,m值基本接近，是同一个数量级。Ks和m值不仅随菌种而异，对不同的限制性基质也不同。Ks的意义：Ks越小，则S增加少许，增加很大，所以Ks越小，就越敏感
9、。Ks可以表示菌体细胞与基质亲和力的关系。,Monod方程虽然表述简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况下与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程。,（3）其他几种生长速率方程式,Tessier方程式（1942年）,当S很低时，代入原式与Monod方程一样。,Contois方程式（1959年）：单位菌体消耗的基质量。此公式对污水处理很重要。,Moser方程式（1958年）：经验常数当1时，上式就是Monod方程,单基质限制的细胞生长动力学模型,3、营养物质对生长的影响,所有营养物质均存在一上限浓度，超过此限，反而会引起生长速率的下降。这种效应称为基质抑制作用（
10、高渗透压作用）。另外，某些代谢产物也能抑制生长。其反应方程式为：Kp为经验常数；P为代谢产物浓度,两种或两种以上的底物同时用于生长时，则可考虑用Monod式的形式表示各种底物与比生长速率的关系：,带有两个生长期,两种碳源（S1和S2）的二次生长,S1,S2,X,第二节 连续培养动力学及连续培养的应用,一、连续发酵动力学,按种类（设备）分：全混流反应器 活塞流反应器全混流反应器分为：恒化器 恒浊器,恒化器：以某种必需营养作为生长限制基质，通过控制流加速率造成适应这种条件的细胞生长密度和生长速率，培养液中限制性底物浓度保持恒定。,恒浊器：通过控制生长限制性基质的流量维持恒定的菌体密度。,1、单级恒
11、化器的发酵动力学,S：限制性底物浓度（g/L）X：菌体浓度（g/L）P：产物浓度（g/L）V：培养液体积（L）F：培养基体积流率（L/h）,F,F,XSP,XSP,X0S0,对菌体,积累的细胞=(进入-流出)的细胞+(生长-死亡)的细胞,F,F,XSP,XSP,X0S0,对限制性底物,积累的底物=（进入-流出）的底物-（生长+形成产物+维持代谢）消耗的底物,F,F,XSP,XSP,X0S0,对产物形成,积累的产物=（生成-流出）的产物,处于稳态时，,由（）、（）和（）得：,在只培养微生物的特定连续培养过程中，假定：无产物形成或形成很少，可忽略不计；维持代谢所消耗的的底物很少，可忽略不计。,根据
12、Monod方程,当DDcrit时，X=0,P=0,恒化器内无菌体与产物，这种现象称为“洗出”，因此当以生产菌体为目的时，不能在最高产率的稀释率下操作，菌体容易洗出，应降低D，操作也稳定。,rP,产物生产率 QP,产物比生产率 dP/dt=rP-DP稳定状态下，dP/dt=0 rP=DP,代谢产物浓度与产率,若产物合成为非生长偶联型，rP=QPX,若产物合成为生长偶联型,若产物合成为部分生长偶联型,2、单级恒化器生产率与分批发酵生产率的比较,连续培养的生产率为：P=DX（）将（）代入（），得,连续培养的最大生产率,对（）求一阶导数并使其为零，计算出：,连续培养时细胞浓度、限制性基质浓度、细胞生产
13、率与稀释率的关系,Pc与Pb的比较（分批培养与连续培养）,实例,以葡萄糖为限制性底物，连续培养大肠杆菌，在培养条件下测得实验数据如下表：,由S/-S回归方程，求得：m=1.08h-1 KS=0.103g/L将实验数据X、S代入（），求出不同X、S下的YX/S，取0.3D 0.7之间的YX/S平均值，得：,限制性基质为碳源时，部分消耗的碳源作为能量供生命活动，X偏低；N，S为限制性基质，D较小时会积累多糖，脂肪等，X偏高；Mg,P,K为限制性基质时，同上，但细胞内这些物质下降，YX/S增大，细胞浓度偏高；复合培养基时，情况复杂，随着变化，限制性基质会改变，X下降。,连续培养结果与正常情况发生偏差
14、,3、带有细胞在循环的单级恒化器,X1S1V1,F,F,(1+)F,F,F1X2,X1,浓缩细胞,CX1,4、多级连续培养,F S0,X1S1V1,F S1,X2S2V2,F2,S0 F0,5、连续培养动力学的应用,确定最佳培养条件富集，选育特殊形状菌种建立选择性的培养环境生长速率不同的菌种在连续培养中的“去”“留”。,在发酵生产中，一般所关心的问题是：如何获得最大的生产强度；在怎样的环境条件、生长速率下可取得最高的转化率；控制什么限制性底物，在何种浓度水平下才能最大限度地避免其它副产物形成。,确定最佳培养条件,例如面包酵母的培养,应用独特的限制性底物、培养的温度、pH极端值、添加各种生长促进
15、或抑制物质等，能够建立起具有高度选择性的培养环境。,建立选择性的培养环境,生长速率不同的菌种在连续培养中的“去”“留”。,Y XZ xW与S的浓度有关,对于Y,对于Z,Z的积累导致导致S浓度的下降，建立新的平衡。,D=0.25Dc时，比生长速率小于X；D=0.75Dc时，比生长速率大于X；,对于Z,本章作业,1、Monod方程是描述什么的？什么是限制性底物？2、微生物生长动力学常数如何测定？3、莫诺方程是否可以描述所有的微生物生长过程？4、何为单级恒化器？5、用单级恒化器连续培养酵母时，最大生产强度如何求算？6、多级连续培养有什么优点？7、在多级连续培养中，前一级反应器和后一级反应器中的底物浓度、菌体的比生长速率、菌体浓度、产物浓度有什么变化？,
