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1、第四章 细胞培养研究技术主讲人：高云副教授,基本操作技术和要求,由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。,培养室内的无菌技术,培养前的准备：按实验计划和程序准备 物品，作到心中有数。培养室和超净台：定期全面彻底消毒洗手和着装：均按外科手术要求实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。,培养细胞的 取材,基本要求：取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留
2、组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。,皮肤和粘膜的取材,皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。取材方法似断层皮片手术，面积2-3mm2.尽可能去除皮下和粘膜下组织。因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。,内脏和实体瘤的取材,内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，标本应按污染组织处理。,血细胞的取材,血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为20U/ml,针管用较高浓度肝素500U/ml湿润。,鼠胚组织的取材,无菌消毒方法小
3、鼠置于75%酒精的烧杯中5分钟固定于消毒的小木板上剪开皮肤解剖取材取材的组织放置于平皿内培养,组织材料的分离,欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。,细胞悬液的分离方法,离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm 转速 5-10分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有Ficoll 400,Percoll,泛影葡胺等。,机械分散法,适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。剪切组织为1m
4、m3碎块 后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞 组织液放在注射器内通过针头压出。注射器针芯挤压后，用PBS液洗涤，分别通过不锈钢筛网80,150,400目孔径筛网。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。,消化分离法,消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得细胞悬液直接进行培养,胰蛋白酶法,主要作用是对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关，对细胞的分离作用与细胞的类型与性质关系密切钙镁离子和血清抑制活性常用剂量为0.25%（0.1-0.5%），pH值 8（8-9）温度 37
5、。,胶原酶法,只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离产品有I-V VII-IX等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织钙镁离子和血清不影响活性,常用剂量为200单位/ml或0.1g/ml 0.3 g/ml,消化分离法,消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得细胞悬液直接进行培养,胰蛋白酶法,主要作用是对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关，对细胞的分离作用与细胞的类型与性质关系密切钙镁离子和血清抑制活性常用剂量为0.25%（0.1-0.5%），pH
6、值 8（8-9）温度 37。,胶原酶法,只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离产品有I-V VII-IX等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织钙镁离子和血清不影响活性,常用剂量为200单位/ml或0.1g/ml 0.3 g/ml,EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。单独使用不能使细胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,第一节细胞的分离和纯化,一、成纤维细胞的分离和去除二、骨髓和外周血有核细胞的纯化三、肿瘤细胞的分离纯化四、单核细胞和巨噬细胞的纯化五、上皮
7、细胞的纯化,一、成纤维型细胞的分离和去除,成纤维细胞样细胞,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,（一）差速贴壁分离法,成纤维细胞有两个特点：1对胰蛋白酶作用敏感，组织块或传代消化时，常先脱落；2原代游离细胞接种后，成纤维细胞贴壁速度比上皮细胞、心肌细胞快。,例1,培养细胞活力
8、测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠,2台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力 已淘汰,3 四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这
9、种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制,操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线,
