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1、细菌内毒素检查法在药品和医疗器械检查中的应用,细菌内毒素检查,本讲座共分三部分一、基础部分二、标准部分三、实验操作部分,一、基础部分,1.前言 防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。1.1细菌内毒素检查法 1885年美国的发表了一篇有关鲎血的化学组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。1956年，美
2、国动物学家F.Bang发表论文鲎的一种细菌性疾病，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。1964年F.Bang和J.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，1968年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)方法。1980年USP20版；1987年欧洲药典、1989年英国药典1989增补本、1988年日本药典第11增补本、1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。,1.2 细菌内毒素在我国的发展,在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，
3、允许4种药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。,2 有关术语及相关内容,2.1热原反应病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。2.2 热原所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原
4、不等于细菌内毒素。2.3细菌内毒素检查法2005年版中国药典定义为：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。2.4鲎试剂我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度用符号表示，单位用EU/ml表示。2.5鲎 鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和东方鲎,2.6细菌内毒素是
5、革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规定1 IU=1 EU。2.7细菌外毒素与细菌内毒素 细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质。细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。,外毒素与内毒素的主要区别,内毒素的主要生物活性：1 发热反应 2 白细胞反应 3 代谢性酸中毒 4 感染性休克 5 弥漫性血管内凝血（DIC)2.8细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准品、国家标准品和工作标准品。在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的
6、内毒素。,1996年WHO 建立第二批国际内毒素标准品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品，共生产8批。细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和实验中的阳性对照。本品为一次性使用。,2.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又可进一步分为O-特异性多糖链、核心
7、寡聚糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是LPS分子中最易变异的成分。,核心寡聚糖分为内核和外核。外核由数种己糖组成，内核含有庚糖特殊的酮糖，这部分结构对不同菌株的LPS基本相似。类脂A是LPS的毒性及生物活性中心。典型的类脂A含有一个以1，6-糖苷键相连的D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架，双糖骨架的游离羟基及氨基可携带长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌合成的类脂A的分子组成及其骨架上的取代基团性质有差异。,3.2细菌内毒素的量值 1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。我国国家标准品981是用IS
8、2为基准标定的我国第6批国家标准品。每支含内毒素9000EU。3.3 细菌内毒素的限值 供试品细菌内毒素限值按一下公式确定L=K/M，式中L为供试品内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为人用最大剂量，以ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均体重按60kg计算。,4中国药典2005年版细菌内毒素检查法的修订内容,中国药典2005年版较中国药典2000年版有重大修订，主要修订内容如下：4.1.定义改变：2005年版药典定义细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来检测或
9、量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。,4中国药典2005年版细菌内毒素检查法的修订内容,2000年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4.2.把中国药典2000年版的细菌内毒素检查法应用指导原则，合并入附录E细菌内毒素检查法。4.3.明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可用其中任意一种方法进行试验，只有当测定结果有争议时，以凝胶法结果为准。,4.4 细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于
10、0.005EU/ml。4.5增加了供试品溶液的制备这一项，明确了供试品溶液的PH 值在6.08.0范围内，配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素，水用细菌内毒素检查用水。4.6鲎试剂灵敏度的定义有所改变 2000年版的定义是：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度；,2005年版的定义是：在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝聚的最低内毒素浓度4.7.把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝胶半定量试验。4.8.凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的平行管数都增加为2支。4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。4.10.较详细讲述
11、了光度测定法的方法。,二、标准部分,2.1 细菌内毒素检查法（中国药典2005年版）2.2 医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法GB/T14233.2-932.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法（卫生部药政局1997年药发1997第81号）,医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法与中国药典2005 年版的比较,三、试验操作,1.简述1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。因此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。1.
12、2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制作用。,1.3 供试品检查时，阴性对照、阳性对照、和供试品阳性对照必须同时进行，否则结果无效。2试验材料及用具 天平、电热干燥箱（180300）、恒温水浴箱（37 1）、漩涡混合器、鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号）、细菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水；其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性安剖等。,3.凝胶实验技术,3.1凝胶法的实验程序 1试验准备：试剂、仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值L 3选择鲎试剂的灵敏度 4 计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有效浓度 5 鲎试剂灵敏度复核
13、6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验 7 供试品干扰试验 8 干扰试验的验证 9 供试品日常的内毒素限量检查,3.2.鲎试剂灵敏度复核内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素国家标准品或国家工作标准品一支，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内。按药典操作。例如使用细菌内毒素工作标准品（150601-2005-10，100EU/ml)时的方法如下：复溶：准确吸取细菌内毒素检查用水1ml假如瓶内，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟，即为100EU/ml。,稀释：取0.2ml内毒素标准溶液加入1.8ml细菌内毒素检查用水为110稀释液，即为10EU/ml内毒素标准
14、溶液。取0.2ml 110稀释液，加入1.8ml细菌内毒素检查用水1100稀释液即为1EU/ml内毒素标准溶液。以后依次成倍稀释分别为0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml，0.0625EU/ml，0.03125EU/ml。在上述稀释过程中，每稀释一步，均需在漩涡混合器上混合30秒钟。,待复核鲎试剂按药典准备,例如：复核湛江博康海洋生物有限公司TAL（0511090,0.125EU/ml）反应结果,数据处理c=lg-1（X/4）=lg-1(-0.903)*3+(-1.22)=0.104EU/ml结果判断 c在2.00.5（0.25EU/ml0.06EU/ml）范围内，本批T
15、AL的灵敏度标示值符合规定，应按标示值使用。,3.3新品种细菌内毒素检查的实验设计方法,设计原理 凝胶法是将等体积的样品溶液和新配制的鲎试剂（各0.1ml）在试管中混匀 371反应602分钟。如果检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有的内毒素浓度等于或大于鲎试剂灵敏度时，就会在试管中显示阳性反应，其机理为内毒素在钙、镁二价阳离子的参与下，首先激活鲎试剂凝固酶系统的C因子，最后将凝固蛋白原变成凝固蛋白。如果药品中存在阻碍或促进该反应的因素时，均会导致结果异常。当检测一个新品种时，须证明该样品本身是否存在这些因素，这就是通常说的干扰试验。当存在干扰因素时，为了排除干扰，最简单的方法就是对其进行
16、适当的稀释。通过稀释，可以降低该样品中干扰成分的浓度。,干扰试验,干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂，但建议使用较低灵敏度的鲎试剂，可尽量避免供试品所含内毒素对干扰试验造成的阳性影响。,内毒素限值（L）的确定,记录供试品名称、浓度C（干粉规格及溶解后浓度），最
17、大人体剂量。例如：注射用盐酸阿糖胞苷（05090801，0.1g/支），最大剂量药品说明书给出为3g/m2计算供试品限值L=K/M K=5EU/kg,人体表面积为1.55m2，体重为60kg,L=5/(3000*1.55/60)=0.065EU/mg选择鲎试剂灵敏度 0.25EU/ml,计算供试品的最大有效稀释倍数MVD=CL/或最低有效浓度MVC=/L=C/MVD按市售鲎试剂的灵敏度为1.0EU/ml0.03EU/ml稀释样品取本品一支加细菌内毒素检查用水2ml溶解，按上述鲎试剂灵敏度范围样品依次稀释为6.5倍、13倍、26倍、52 倍、104倍。预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度
18、或最小不干扰稀释倍数。为正式干扰试验提供依据。,预试验,制备NPC稀释系列（不含内毒素的供试品稀释系列）制备PPC稀释系列（含2 内毒素的供试品稀释系列）确证PPC的有效性。反应 TAL+NPC;TAL+PPC 每个浓度平行2管。2 0.25 0.125 NC PCPPC NPC 以上结果确认，本品的最小不干扰稀释倍数为13倍。并且用灵敏度0.25EU/ml以上的鲎试剂检查,3.4供试品干扰试验,试验程序1计算：供试品的内毒素限值L=K/M2选择：鲎试剂灵敏度3计算：供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度4根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍数或有效浓度5制备：2、0.5、0.25内毒素水溶液E
19、S系列 2、0.5、0.25内毒素供试品溶液Et系列6反应：TAL+BET水（NC）,TAL+供试品溶液（NPC），平行2管，TAL+ES系列,TAL+Et系列，平行4管7结果判断：试验有效：NC管全部阴性（-），NPC全部阴性（-）TAL+ES系列：2管全部阳性（+）,0.25管全部阴性 TAL+Et系列：2管全部阳性（+）,0.25管全部阴性8 数据处理：供试品在该浓度下无干扰2.0ES0.5，2.0 Et0.5,若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂,3.5供试品检查,1日常检查包括2支供试品管，2支阴性对照，2支阳性对照，2支供试品阳性2检查程序供试品：按MVD稀释供试品溶液
20、内毒素：BET水复溶稀释为2内毒素水溶液 供试品溶液复溶稀释为含2内毒素供试品溶液3鲎试剂：BET 水复溶,3.6供试品稀释举例,假设选择鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml 1 复方利多卡因注射液：L=1.8EU/mg,规格40mg/5ml；MVD=1.8/0.25=7.2倍稀释过程0.5ml（8mg/ml）4ml 1mg/ml（1mg/ml1ml（1mg/ml）3.6ml(3.6倍)1ml2ml(7.2倍）2.注射用克林霉素磷酸酯：L=0.21EU/mg规格0.3g/支，加水3ml 稀释100mg/ml MVD=100*021/025=84倍取0.2ml 4.2ml(21倍)取1ml4ml（84倍）,结束语,随着内毒素研究工作的进展，细菌内毒素检查法应用范围越来越广，用于药品成品检查的品种越来越多。制药工业上更是日益显示出它的应用价值，该法用于药品生产过程检查，属于一种事前控制的制控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义。在临床上检测机体内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，也可用于指导临床治疗。,谢 谢 大 家,
