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1、细菌内毒素检查法（凝胶法）,苏州大学 卫生与环境技术研究所,内 容,基本概念实验方法操作注意事项,细菌内毒素,细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。,一、概念及相关知识,热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。热原：任何可以导致肌体发热的物质。机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。,外源性热原质,吞噬性白细胞,内源性热原质,体温调节中心,发 热,新蛋白合成,新mRNA翻译,1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。所
2、有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。热原检查法的局限性：1、重现性差。2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。4、非定量反应。虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。,细胞壁结构：肽聚糖 脂蛋白革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。脂多糖结构：多糖O抗原核心多糖类脂A,致热活性部分,细菌内毒素的生物活性,1、致热性。2、致死性毒性。3、白细胞减少。4、激活凝血系统。5
3、、降低血压，休克。6、Shwartzman反应。7、刺激淋巴细胞有丝分裂，等等。,细菌内毒素的耐热性,细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能去除细菌内毒素，需250至少30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活。,实验用器具的处理,内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可能存在的外源性内毒素。耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180干烤至少2h或者250干烤至少30分钟；塑料器皿置于30双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，60烘干备用。,细菌内毒素的单位,内毒素的量值：1、内毒素单位（EU）1982年FDA将当时美国代号为EC2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位
4、（EU）被USP正式引用。2、国际单位（IU）WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确1IU1EU。,细菌内毒素检查法,凝胶法 浊度法 光度法 显色基质法 重现性好 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间,方法分类,方法特点,细菌内毒素检查法概念,本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法，由于凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同试验方法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法为准，所以凝胶法被广泛
5、应用。,鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。,凝胶法概念,凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。,鲎试剂与内毒素反应机理,内毒素,C因子,活化的C因子,凝胶,B因子,凝固酶原,凝固酶,活化的B因子,凝固蛋白原,鲎凝血系统酶联反应,二、细菌内毒素凝胶法,实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度
6、，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品内毒素限量检查,凝胶法中用到的仪器,1.超净工作台,凝胶法中用到的仪器,2.恒温培养箱 孵育样品浸提液以及培养试验结果。,凝胶法中用到的仪器,3.干烤箱 用于实验用耐高温器皿的去热源，温度范围要求至少300,凝胶法中用到的仪器,4.移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸管）5.计时器、漩涡混合器、电子天平等,凝胶法中用到的器皿,凝胶法中用到的试剂,1）鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2）细菌内毒素工作品 3）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于0.015EU/ml的无菌水）4）75乙醇,鲎试剂灵敏度复核试验,当使
7、用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,鲎试剂灵敏度复核试验,根据鲎试剂灵敏度的标示值（）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2、1、0.5和0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。,鲎试剂灵敏度复核试验,取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入371的适宜恒温器中，保温
8、60分钟2分钟。,鲎试剂灵敏度复核试验,结果观察 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180后从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,鲎试剂灵敏度复核试验,若最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c），计算方法见中国药典。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当c在0.52.0（包括0.5和2.0）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度
9、。,凝胶法的试验步骤,下面我们结合中国药典2010、GB 14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810一次性无菌注射器 来学习具体试验方法。,实验步骤,浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：V浸提介质体积，单位为（ml）；L产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的细菌内毒素的量），单位为EU/件；鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。,实验步骤,样品处理方法：a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（371）恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验；b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（371）恒温箱中孵育不
10、少于1h，取浸提液进行试验。制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的PH值在6.08.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。,实验步骤,结果观察,B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体，不滑落。而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可信的。最后看A溶液的反应情况：阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不合格；阴性就说明小于20EU,结果是合格的；1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断合格；否则判断为不
11、合格。,注意事项,1.每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的复核试验；2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。3.在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入避免气泡。4.保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶受到振动后变形而误判为阴性。,注意事项,5.冻干的鲎试剂应存放在2-8下；避免长时间放置在高于25的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在2-8的冰箱里，可存放24小时，在-20以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。,三、操作注意事项,试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便
12、于除热原、计量准确、清洗操作方便。洗净 去污去内毒素 去洗涤剂 精洗 除外源性热原：250 干烤至少1小时。2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后250 干烤至少1小时。3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。,实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。实验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。,振荡前,振荡后,内毒素分子在水溶液中的状态,3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。6、恒温器的温度变化应1，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在602min，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。7、使用的试管为10mm75mm，10为试管外径。,结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转180，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。其他：试剂购买。,谢 谢,
