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1、12当代及子代行矫正对缺陷的生殖细胞进基因治疗生殖细胞(germline)cell)基因治疗体细胞(somatic只限于某个体的当代基因的改变只限于某一体细胞的342.1.65.4.3.56位修复不涉及基因组的任何改变。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原目的将缺陷基因的异常序列进行校正。因组内原有的缺陷基因。通过定位重组导入的正常基因以臵换基定义指将特定的目的基因导入特定细胞genereplacement7(genetargeting基因同源重组技术又称为基因打靶一治疗策略得以实现。行部分基因序列的交换使基因臵换这因的载体就能找到同源重组的位点进因组DNA具有相同的序列。带有目的基定向整合的条件
2、:转导基因的载体与基8正常基因重组载体正常基因定位重组技术染色体缺陷基因9利用其表达产物达到治疗疾病的目的。B.向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因的功能导入正常基因的表达产物补偿缺陷基因因而细胞内的缺陷基因并未除去通过A.在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基类型身不表达的基因。定义通过导入外源基因使靶细胞表达其本(geneaugmentation)10例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。之不能表达以达到治疗疾病的目的。达或者通过破坏某个基因的结构而使定义采用特定的方式抑制某个基因的表geneinterference11除肿瘤细胞的目的。细胞产生“自杀”效应从而达到清前体转化为细胞毒性代谢物
3、诱导靶这种基因编码的酶能使无毒性的药物原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。1213制DNA聚合酶活性导致细胞死亡。转变成毒性GCV三磷酸核苷后者能抑似物丙氧鸟苷ganciclovir,GCV胸苷激酶特异性地将无毒的核苷类thymidinekinase,tk基因编码simplexvirus,HSV型胸苷激酶A.TK/GCV单纯疱疹病毒herps14变成毒性产物5-氟尿嘧啶5-FU。细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶5-FC转cytosinedeaminase,CD基因在B.CD/5-FC大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶15其明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。杀基因”的肿瘤细胞也被杀死
4、。被杀死而且与其相邻或远处的未转导“自使导入了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后旁观者效应“自杀基因”导入后不仅16癌免疫反应。因导入肿瘤组织以增强肿瘤微环境中的抗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基1718胞回输体内将重组靶细接输入体内将目的基因直invivo目的基因载体靶细胞,体外培养靶细胞将目的基因导入患者exvivo19达到治疗的目的。该基因在体内有效地表达相应产物以过筛选和增殖后将细胞回输给患者使是指在体外将目的基因导入靶细胞经2.间接体内疗法exvivo达。织器官使其进入相应的细胞并进行表是指将目的基因直接导入体内有关的组直接体内疗法invivo1.20是逆转录病毒载体。病例使用了病
5、毒载体其中用得最多的据统计有72%的临床实验计划和71%的因此它也是使用最多的基因治疗载体。病毒载体介导的基因转移效率较高21人类免疫缺陷病毒HIV+ssRNA逆转录酶核心蛋白膜蛋白一逆转录病毒Retrovirus载体22逆转录病毒的生活周期23逆转录病毒的生活周期24逆转录病毒的生活周期25C.在R内还有poly(A)加尾信号。B.U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)A.U3内有增强子和启动子2LTR由U3、R和U5三部分组成。1两端各有一长末端重复序列LTR。26及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。45端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列3病毒有三个结构基因gag、pol和
6、env基因27LTRtherapeuticgeneLTR但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。粒包装蛋白基因它可以克隆并表达外源基因保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒颗(1)逆转录病毒载体2.逆转录病毒介导的基因转移系统28gagpolenv身不能被包装成病毒颗粒。转录病毒载体包装。由于缺乏包装型号本建而成。该细胞株能合成包装蛋白用于逆它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构(2)辅助细胞株2.逆转录病毒介导的基因转移系统29Retroviralpackagingsystem30久表达。组中有利于外源基因在靶细胞中的永前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因靶细胞。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入包装好的
7、假病毒颗粒易于分离制备。失不影响其他部分的活性。逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺3.31容纳7kb以下的外源基因。逆转录病毒载体的容量较小只能因的潜在危险随机整合有插入突变、激活癌基4.32AVadenovirus33进入宿主细胞基因组中。至细胞核内保持在染色体外不整合用进入细胞内然后腺病毒基因组转移膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包AVadenovirus345.腺病毒载体容量较大可插入7.5kb外源基因。入或气管内滴注4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸3.基因转导与细胞分裂无关2.宿主范围广1.基因导入效率高354.靶向性差。助
8、细胞或患者体内野生型病毒发生重组。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒载体与辅2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。表达时间相对较短。1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因36只能建立溶源性潜伏感染。苗病毒存在时才能进行复制和溶细胞性感染否则复制只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘kb无包膜外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5腺病毒相关病毒(adenovirusassociatedvirusAAV)AAVVirusParticle37REP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因StructureofAAVVirusGen
9、omicDNAITR反向末端重复序列3839可能会引起免疫排斥。在40%-80%的成人中存在过感染感染效率比逆转录病毒载体低。纳5kb外源DNA片段AAV载体容量小目前最多只能容胞40非分裂细分裂细胞、5kb胞非分裂细分裂细胞、7.5kb7kb克隆容量分裂细胞高安全性较定点整合能丢失不整合可效率高随机整合毒载体腺相关病高安全性较体腺病毒载毒载体逆转录病可能致病感染细胞安全性整合特点41目的基因转移至细胞内并进行表达。即可通过细胞内吞作用将外源DNA即DNA的脂质体然后与细胞一起孵育与DNA混合后可以自动形成包埋外源基本原理利用阳离子脂质体单体一脂质体介导的基因转移技术42脂质体介导的基因转移示
10、意图4344受体介导转移技术示意图4546RNARNA4748异进入肝细胞。成为运载核酸的工具。可以专一性地使反义RNA特聚赖氨酸PL共价连接得到ASGP-PL复合物解决举例:将脱唾液酸血清类粘蛋白ASGP与多反义RNA进入靶细胞前的降解问题专一性转移问题反义RNA的关键技术问题49环境中的核酸酶的降解作用。间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗被转移的RNA是被保护的与周围环境之高受体介导的RNA转移十分专一而且效率法可以实现受体介导的反义RNA转移。借助前述的受体介导基因转移方二受体介导反义RNA技转移术504能直接作用于一些RNA病毒3具有剂量调节效应2反义RNA设计和制备方便l安全性高51
11、解过程导致靶基因的表达沉默。由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降RNAinterferenceRNAiRNA52一RNA干扰机制示意图53二RNA干扰的应用前景54保守区域构成酶活性的结构域与靶序列互补的区域(ribozyme)55核酶的作用机制56mRNA分子。交链上解脱下来重新结合和切割其它的重要的是核酶在切断mRNA后又可从杂定的空间结构不易受到RNA酶的攻击。更与一般的反义RNA相比核酶具有较稳57以及治疗基因的诱导表达等。用病灶微环境使治疗基因特异性表达部调节机制、基因外部调节机制、利其策略大致有以下几种基因内方面。疗基因表达的时间、空间和水平三个治疗基因的受控表达包括控制治58
12、子元件如甲胎蛋白(AFP)基因。使用病变细胞的组织特异性启动子、增强元件例如酪氨酸酶基因。使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子5960炎症组织特殊微环境等。微环境肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等比如三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达61件仅对这种转录激活剂有所响应。控制另一种则是特异性基因表达调控元活剂它与DNA结合的活性受某种诱导药物这种系统的必要成分一种是转录激统。必要开发和完善一些可诱导性基因表达系为了防止其表达不再受外界控制所以有四、治疗基因的诱导表达62除使四环素抗性基因的转录得以进行。和性造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解四环素存在时阻遏蛋白与四环素具有极高的亲序列结合
13、阻断四环素抗性基因的表达。无四环素存在时阻遏蛋白与四环素抗性操纵子四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。63AD的融合体。是野生型Tet阻遏蛋白TetR与一活化蛋白Tet-Off系统中Tet控制的转录活化子tTA64合特性变为方向rTetR)。Tet-On系统中TetR中四个氨基酸变化使其结65667囊性纤维化病6家族性高胆固醇血症5莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病3血友病和其他血浆蛋白缺乏症2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病(PNP)缺乏症1腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶67功能缺乏。脱氧腺细胞内堆积淋巴细胞死亡机体免疫病理腺苷脱氨酶
14、缺乏脱氧腺苷不能脱氨氨成为脱氧肌苷最后代谢为尿酸排出体外。谢中起重要作用使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱生理腺苷脱氨酶是一种细胞内酶在核酸代腺苷脱氨酶缺乏症第一例基因治疗68的淋巴细胞中表达新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因酶基因的淋巴细胞应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨1983年腺苷脱氨酶基因被克隆腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂69LTRnoneoeSV40ADALTRFrenchAnderson(NIH) Frecerso(I)nNHnhAndeteer14,1990 September14,1990SpmbADA缺乏症ADA乏症 缺70Injections Ijectiosre
15、peated reeate77times tiesinifirst first1010.55months otsmnhnmdpnnAshantideSilva satieilvaAhndS%2525%ADA:11%ADAgee geneteray therapy.phnatiet patienttotobeetreated treatewith itdwhbnpAshati santiwasasthe tefirst firsthwn Ah71脱氨酶含量基因等方法选择阳性细胞检测细胞内外腺苷清洗淋巴细胞去除多余病毒载体。应用抗性细胞录病毒载体混合培养使腺苷脱氨酶进入淋巴将病人淋巴细胞与携带腺苷
16、脱氨酶基因的逆转抽取病人骨髓分离淋巴细胞72以后又连续进行了多次输入经如上治疗后患病女童免疫功能基本恢复。以调整和重复密切观察病人各项免疫指标的变化必要时加带有此基因的淋巴细胞输回患者体内确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后将73%55%Factor FactorIXI:X皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞薛京伦(复旦大学)薛京伦复旦大学1991, 1991,乙型血友病74是我国基因治疗成功的例子。F基表达水平达正常人的5%。体外培养回植病人皮下F基因表达91年导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞养F表达导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞体外培导入仓鼠细胞CHOF表达3LTRPSOSVneoFLTR5重组
17、体逆转录病毒载体+FcDNA75基因治疗耐药基因治疗。提高化疗效果的辅助基因治疗药物增敏肿瘤的免疫基因治疗。自杀基因治疗分子化疗基因干预技术基因增补常用基因治疗策略762.基因干预抑制病毒复制1调节机体免疫应答77并经过动物实验验证等。要用于单基因遗传病治疗、疗效显著只限于体细胞提倡间接体内法、主1999年首例基因治疗失败事件1.安全性问题78防止不当应用如体育上禁止用于生殖细胞2.社会伦理问题79靶细胞选择c.安全高效载体构建及转移技术b.目的基因及调控元件选择a.3.技术问题80重组载体pRevTRE/HSVtk构建流程-81MCF/TRE/tk/Tet-On细胞株的建立82BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立83DDox+GCV+病毒组BGCV+Dox组CGCV+病毒组ADMEM组BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验84BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后的肿瘤体积853GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤4Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤1DMEM组荷瘤裸鼠肿瘤2GCV+Dox组荷瘤裸鼠肿瘤100bpMarkerM:RT-PCR检测肿瘤组织HSVtk的表达水平86与方法。的常用方法治疗基因的受控表达原理熟悉基因转移的基本技术基因干预掌握基因治疗的基本策略及常用载体。目的要求87
