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1、上海劲马实验设备有限公司RD ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY-大鼠 (Rat) IV型胶原 (Co IV) ELISA 检测试剂盒本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆试验原理：Co IV试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知Co IV浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将Co IV和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中Co IV的浓度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份（2-8保存）96孔
2、配置48孔配置配制96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：800ng/ml1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型生物素标记的抗Co IV抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型亲和链酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）
3、即用型标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型自备材料1 蒸馏水。2 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3 振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4 使用一次性的吸头以免交叉污染，
4、吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。样品收集、处理及保存方法1、 血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2、 血
5、浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000g离心30分钟去除颗粒。3、 细胞上清液-1000g离心10分钟去除颗粒和聚合物。4、 组织匀浆-将组织加入适量生理盐水捣碎。1000g离心10分钟，取上清液5、 保存-如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。试剂的准备1 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：800 ng/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50
6、ul。400 ng/ml（5号标准品）100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液200 ng/ml（4号标准品）100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液100 ng/ml（3号标准品）100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液50 ng/ml（2号标准品）100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液25 ng/ml（1号标准品）100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液0 ng/ml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50ul。2 洗涤缓冲液（50）的稀释：蒸馏水50倍稀释。操作步骤1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入
7、大量的气泡，产生加样上的误差。2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。3 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。4 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，
8、振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。8 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。9 在450nm波长处测定各孔的OD值。建议使用的实验方案标准品浓度（ng/ml）A800800样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品B400400样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品C200200样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品D100100样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品E5050样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品F2525样品样品
9、样品样品样品样品样品样品样品样品G00样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品H样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品局限6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。试剂盒性能1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2. 特异性：不与其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。结 果 判 断 与 分 析1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的Co IV标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的Co IV含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。3、检测值范围：0-800ng/ml4、敏感度： 1.0 ng/ml上海劲马实验设备有限公司
