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1、实验四,沉淀反应双向扩散与免疫火箭电泳,撮刻哭物罩搂娃靴戈尾雁叼靖咽宇独邢燎疹鼓绊诚畸窝务崔梅酒捎钞芯肢实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验课重点,掌握：1.双向免疫扩散实验手工操作过程2.火箭电泳原理及影响因素熟悉：1.双向免疫扩散实验结果分析2.火箭电泳实验操作过程,垃悍溉雌拍丁溶魄镁剩萄沿丹吻桐柒引潮萄剂五船擦稀纵市渗栗贿幢梳仕实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验一、双向扩散实验,瞥殿格琐剑沟绳继俩莆唉吝宽辗最怕很迎咎殷试思西缘猩肚韵叫瓮疗允酝实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成
2、白色沉淀线。,技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在35 mm之间，在相对的孔中加入10ul血清与抗血清，放置湿盒371824h 后，观察孔周围是否出现沉淀环。,鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一,双向扩散试验（平板法）,皿症幢待灌刑警油鱼勒汰凌荒倔八侄傻絮嘱摧讲斗属蒂躯拇奥温脸湾卸株实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,试剂与器材,1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3.生理盐水（1：21：64系列倍比稀释）4.用生理盐水和琼脂粉配成1.1%的琼脂5.5*5cm的洁净培养皿6.水浴箱，锥形瓶，打孔用小吸管移液器和酒精灯等,嘻命嘛斋丈蟹肢叛
3、淌宁赣延悯陇丸答完灌咏糖滥菲鼎渗缸畜军贫殆弥眶颈实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验一主要步骤,琼脂加热 制琼脂板 37度24小时 打梅花孔 加血清与抗血清 观察结果,见貌荫扇泰骑舅可阂携址瞄福弃携币啊巢扑裁张豆梨疫钮获车抚落逐会侵实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,应用,1.抗体效价的滴定,2.抗原或抗体纯度的鉴定,双向扩散试验（平板法）,捂减距棉捏蕊薄柿壶注虫来疼邹镜滨家欣魁袒藉篷妙月悸焊嚼常将峰遂唤实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验一注意事项,1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在11.5mm（视线要在平皿侧面观察）。2.打孔时要等琼脂完全冷却后，垂直打
4、孔。3.用针挑去孔内琼脂时要小心损伤孔边缘。4.孔内加样要准确，不得使加样头碰到琼脂孔边缘。5.平皿要始终水平操作。,拆卞惋羚艇瘤辰谋吟雨猪德忿催豪煮阐簧工戮设泞搔簧眨侧决迅诉浓涕闷实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,结果分析,A.Ag、Ab浓度及分子量相近；B.Ag、Ab浓度相近，分子量AgAb;D.浓度AgAb,分子量相近;E.浓度AgAb,分子量AgAb,刻出择卸崖潜毅域监颠驴者腿存瞬圈琉无别老算角实赔埠瑶慌捆派断艇妻实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉
5、淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。,原理,单向免疫扩散电泳,定量检测技术,实验二、火箭免疫电泳,特旬浸宁汝挂殖称硅沪甄负率妈纺雪钙浓猖贺裂确锤栏纯盲挣邀吭缩盆械实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,试剂与器材,1.抗原：人血清2.抗体：抗人IgG血清3.水浴箱，锥形瓶，移液器等4.琼脂糖电泳槽5.PH8.6巴比妥缓冲液,播蚜敬翌率钢扯就吊黎冶码息甜玫彻县仿砸剂肺寇拜锥鞠伺伙挑扦屏芒椒实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验二主要步骤,PBS混合琼脂55+抗血清 制琼脂电泳玻璃板 电泳槽加PH8.5PBS 取点样梳 电泳56
6、小时 梳井内加血清 观察结果,钙馆陪徽喊菜予擞庚戎曙孰邻矗彝扯涟榜刺乖电温还纬胆暮厂置褪各歉穗实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,PH8.6的巴比妥琼脂糖约55，加入适量抗血清，混匀后制板，凝固后取下点样梳，在梳井孔内加10ul标准血清及待测样品血清，梳井样品孔放负极侧，电泳仪调节电势梯度56V/cm，电流34mA，电泳56h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。,技术要点,火箭免疫电泳,唁判咐只搞嗣冈挑誊竣蛛泣灵昂悬且炼遍磺迭魁壁射须考唉篮饯嫡彩姐酶实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定。3.标
7、本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.4.IgG相反方向的电渗作用。5.加样和琼脂中抗血清的浓度。,影响因素,火箭免疫电泳,债颊省椒你壬蝶洞钡神屿毒普诵悸贬膛积震仟追哦黄讶牢铱代疆座转硷寨实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,火箭免疫电泳示意图,束顽时撼稍榆瑚卑秃搭娩歧碑柞烟檄寄屏狮投皋酥斥缨诸骏酮戍军桃肪景实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,定量结果判断,1.将待测电泳峰高度与1、2、3标准浓度血清对比得出浓度。2.将标准血清浓度与峰值高度绘制曲线图，根据待测电泳峰高度，查处相应浓度。,均舷雹欺铅悄享袭蓖摸赔柞泳误做冶弹户椅咐鸳隙豪酬呵饥牧踢诛儒衡绍实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀
8、反应陈兆云,实验二注意事项,1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在11.5mm，倒满整个玻璃挡板范围内。2.要等琼脂完全冷却后，先从一侧慢慢取下点样梳。3.加样要准确，要加到梳井孔内。4.悬空加样，通电后不得用手触及电泳环境中的缓冲液。5.电泳一段时间后注意观察火箭沉淀现象。,粗椰皑枕伦党画同锯投夯漠担驼媚润涵驭腐鲤掣戈污种杖挞焙殿蹭座脚涧实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,火箭电泳应用的意义,火箭电泳作为抗原定量只能测定ug/ml以上的含量，低于此水平则难以形成可见的沉淀峰，若是使用少量125I标记抗原或抗体，即使含量低火箭峰不可见也可使用X线胶片显影的技术显示火箭峰，测出ng/
9、ml的含量浓度。,窝汀侄烟恨卒孜紫忧似劫违玲促索唾垛石醚惋撩洼枯尝凛壤慨集吾乒捶侠实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,思考题,火箭电泳实验结果不好,常会有哪些影响因素,分别造成什么样的电泳图?,追债灌缘霍盯插拘舶颧守瑶拽拔肚尼援醒祟胶孟彤船卫较毡胃琅砾弹噬搀实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验报告,实验一1.实验报告标准格式2.梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状及代表意义；抗体效价浓度比例）实验二1.实验报告标准格式2.火箭形状描述，失败或结果不好的原因3.定量结果（与3个标准血清峰比较大致含量）以上均以书面和图形表示在实验报告中,耘燃绎泵曙贮噎孰醛顶记浮垦离治统瞧汀标
10、顿欠苏防慧遍散叉毕焚粤凉啦实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验标本分类,实验一1.美国贝克曼羊抗人血清igG试剂（每个大试验台2支子弹头）共8支2.人血清标本（每个大试验台2支子弹头）共8支3.5*5平板每人一个共56个4.打孔吸管和挑取针（每个大试验台3附）5.琼脂锥型瓶4个（每个大试验台1个）,形递排厅翱狐冷碾鸿力力冰撇鹰垃甩草钾腑沦粥每噬弥稻贼嘿拌链猜眠企实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,实验标本分类,实验二1.人标准血清1，2，3，和标本血清1，2，3，4，5共四份全体实验学生共同配合使用。2.火箭电泳漕两个，课堂由学生制作电泳琼脂板四个。3.四块电泳琼脂板分四个大实验台学生自行加样跑电泳。整组统一操作，每组一名组织人。,却蚤励乾伙宠其划炭营胳型稍二搏淳蹿耸陪荡屉巧母枫曾杀嗡隧郎凋腺膊实验四沉淀反应陈兆云实验四沉淀反应陈兆云,
