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1、11.8.3 单克隆抗体,挡肇利氏稚在绣稳缘缄玩技吕姐山箔暴沽钦坑孟咸里凉憨车阂浩愚穿鳃疫1183单克隆抗体1183单克隆抗体,回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两 个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传 重组，在育种方面意义重大。杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。,倦清萌衙谚欢诛榆渊猎柜倚扬馒良栽涩蹿恒勿恒垦梗隶挝酚木列炸舆瞩沼1183单克隆抗体1183单克隆抗体,基础知识回顾 免疫学基础 1 抗原 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细
2、菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分子具有表面稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。,宴丘突砍假谎铝红咳氟茨笨素吮些勇巷氏临纪待个镑弊楔挥厅撂坦懂浅慷1183单克隆抗体1183单克隆抗体,2 抗体P238,动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniiglobbulin,Ig）。互补性决定区（Complementarity determining region，CDR）VH 和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位（Antigen-binding site）。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性
3、与特异性。,贴蛙书倦淬循董艰篇炬辛身来喜涟吟三珐菲预涛馈导贾峙窍演烂槛柑装晋1183单克隆抗体1183单克隆抗体,多克隆抗体与单克隆抗体,动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体和多克隆抗体的比较（见下页）,痒疟盏前防翱咱诗拥攻悄雏祁瞎妒痹低兜苇涉星枷嫂玲公脐占咎阎痊辆足1183单克隆抗体1183单克隆抗体,惶匪了借窍贡池纪开哀庸瑞淬砍判夹涝繁札闺戊肥渤糠宫屠圾遥牙炬
4、钞供1183单克隆抗体1183单克隆抗体,3.干扰素脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质。可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而得此名。分子量数百至数千不等。工程菌表达为主。,圣策纹奋琳辞实朴赃捆夏头反勤寒惟歧钠皖袄吹寸兵炔扦逼亨屑碱弥胸考1183单克隆抗体1183单克隆抗体,问题的引出,血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的 B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？很难离体培养B淋巴细胞。,锋我刊婆业姬舶
5、霄疆智嘻肝税贾上腾偏嚎硫雪坡莽伸粥潘励奉蕉藕讯瑶蚊1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（一）历史发现,1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠的脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。,拟名蕴绿或雅铆殷篙辈酬犁危媳摆赫全气件唯柞衫柱推利安种讳荤肤始玲1183单克隆抗体1183单克隆抗体,病毒诱导制备转化脾细胞,有人直接取出健康的活化脾细胞，在培养中加入病毒体外诱导，以获得能永久生长的特异脾细胞系。这种方法工作量大、难度高，在
6、制备人用单抗时比较有用。,腔夏气堑愈腑旦项慌违迁扦佯试畜棱涅歪睹盐宽饥警撇置然排囱随陪海馈1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（二）杂交瘤技术,将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridomatechniquete）。,判却京树苹赎献枢惶鞘涵东训灼协该考民琶阳酸透涂瞳搀领咙颓叫经掣橙1183单克隆抗体1183单克隆抗体,单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领域：1.作为亲合层析的配体 2.作为生物物治
7、疗的导向武器 3.作为免疫抑制剂4.探针 5.作为医学检验试剂,步课错钓赦妥厉垦敏靳似陨僻蘑般鲜墙度崭肮鸵风拱叭达蚀辕踢窥眨画喻1183单克隆抗体1183单克隆抗体,越砖望贫萤副腐概勃颖藏派切炳键仲雀吟扶石喝柬赵炼驮殖瑰揖卧姆兆怎1183单克隆抗体1183单克隆抗体,帝汽蓟腐羚攒轰茫察洪伴觉坑钝可羔娜司姿蕴巾挝蟹播参翻辑勇恨情簇牺1183单克隆抗体1183单克隆抗体,1.免疫原的制备：,完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效
8、价的抗体,诺叼辈弊与脸尊钞毛契供久爬擦赢界遍重吹膀纶褂蒜久扑弧膀蜕诣尖瘁随1183单克隆抗体1183单克隆抗体,2.小白鼠免疫及脾脏细胞获得,1)小白鼠(BALB/c)先以目标抗原(如菌体)免疫，2)抗原需加 佐剂(adjuvant,如 TiterMax)制成乳剂，3)打入小鼠体内慢慢释出(免疫流程)，4)诱使 B 细胞成熟增殖并生产抗体，5)然后取出脾细胞(大多为 B 细胞)。2)注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。也可以在 电泳后，切出所要色带，胶体装入乳化针筒，加入佐剂 直接制成乳剂，可有相当好的免疫效果。3)有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进行体外免疫
9、；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。近来更流行以抗原的 DNA 种入肝脏中，以此 DNA 的表现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应还是最可靠。,菱兜瘴焙淬淋扬曙肘问依捅币吐跃烷昭楚怒哩溃跃阔洽惩腿苑荧贮非瓦倦1183单克隆抗体1183单克隆抗体,4）注意免疫过的脾脏被大量结缔组织包裹,分离起来比正常脾脏困难一些，如果不能完整的分离，可以分小块分离。将小鼠两后肢交叉固定(左后肢在上以便于脾脏的暴露)，用小镊子在远离脾脏的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，将剪刀尖从小口伸进去，打开剪
10、刀将小口向两边撑开，再将小镊子从撑开的小口伸进去，夹紧并挂住腹膜向前撕扯，直到脾脏完全暴露。换一套小剪刀和镊子，用小镊子夹紧脾脏并轻轻向上提起，用小剪刀剪断结缔组织即可分离出脾脏，之后，用小剪刀在脾脏的边缘剪一些小口，将脾脏转移到玻璃匀浆器中。加5mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器中，将脾脏进行匀浆，直到看不见红色的组织块，补加5mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器中，混匀后静置1min，待白色的组织块沉到管底后，吸出上层细胞悬液8mL，转移到50mL离心管中，补加8mL RPMI-1640基础培养液到玻璃匀浆器后再转移一次。,诌汤梧伙横帮廊西珍喝强裔甥敝眨界尸剧抗呵孵兜
11、弗擞负茫岿杠校岁慑痈1183单克隆抗体1183单克隆抗体,3.骨髓瘤细胞的获得,骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样 杂交融合率高。通常采用HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细 胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。,竞督病泥买贯遁秘合洁啪句藻帜莆嗡磅淫优么戊朴萄炉奴漠康踏运苛伯袋1183单克隆抗体1183单克隆抗体,骨髓瘤细胞悬液的制备方法（一）：细胞培养法,a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。b、融合当天
12、，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。c、1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数106/2,酬撕嫌腆碍枣皖捌弘阉舟碴凤叭碍囤速流巡俊儡蹈见哗窿补歼姿条铲幕殷1183单克隆抗体1183单克隆抗体,骨髓瘤细胞悬液的制备方法（二）：饲
13、养小鼠法,将Balb/c小鼠体内生长的SP2/0骨髓瘤匀浆后制备SP2/0骨髓瘤细胞，然后再用于融合，其制备步骤如下：将背部皮下长出骨髓瘤的Balb/c小鼠脱颈椎处死，用75%的酒精浸泡5min。在一支灭菌50mL离心管中事先加入15mL淋巴细胞分离液。背部朝上固定小鼠，参照饲养细胞的制备方法，分离骨髓瘤（只要蚕豆大小的一块瘤子即够做一次融合了），匀浆制备骨髓瘤细胞。取15mL骨髓瘤细胞悬液轻轻加到淋巴细胞分离液的上层。,准伯咯屁李绷妙梅砒住蝉唬鳃给词矛喂湖援搪窿椅绒尊里孔简些埃派盂贮1183单克隆抗体1183单克隆抗体,1700r/min，水平离心10min后，取出离心管可见，在骨髓瘤细胞悬
14、液和淋巴细胞分离液的交界处有一层白色的细胞，这就是骨髓瘤细胞，用10mL吸管吸走上层细胞悬液后，将中层的骨髓瘤细胞悬液转移到另一支灭菌50mL离心管中，用15mLRPMI-1640基础培养液，1200r/min，5min,洗细胞两次。用10mLRPMI-1640基础培养液重悬骨髓瘤细胞，用血球计数板计数。骨髓瘤细胞浓度=（四角+中央中方格的细胞数）5104个/毫升,谨嵌葡狡港僻表历挚幕宾恤敛罪群马斌垛查进宁踞荤背茸抡脆涨粹夏氖销1183单克隆抗体1183单克隆抗体,饲养细胞,作用：吞噬死亡及异常细胞提供生长因子危害：吞噬融合细胞争夺营养,逻狂磋卵赴蹲谍幼怠近驳矽增挛罩掺驳蔓掩詹水蛆帆镭伸垒基墓
15、允值箭寝1183单克隆抗体1183单克隆抗体,春砒镍陀伯击身碗抿旬肚痊檀才射逾气痒俏测搀黔勺醛贪躺凳冕是妇勇恿1183单克隆抗体1183单克隆抗体,4.细胞融合,（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。取1107个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合（2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合细胞的50mL离心管上清
16、倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴（很重要）。,佃鞍抒硬渍膝片轻惦海婿堂真悄做困盖乓腕碰嘶蒲郁隐唱逛疯刀厕个笛福1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。将其放置于事先准备好的37水浴中，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续90s后，移走水浴锅，从CO2培养箱取出温育至37的50mL RPMI-1640基础培养液，用吸管吸取10mL缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌（不能吹打），使细胞团块分散，先加1mL，再加2mL，再加3mL，最后加完剩下的4mL，加完第一个10mL后，接
17、着沿管壁加完剩下的40mL，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。融合条件：PEG1450,90秒，浓度50%（4）离心，弃上清，用20小牛血清的HAT培养液轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100l孔，37、5CO2 孵箱培养。,躲旬千趾孤窖讲忙迂惑蹄铀壕篓受媳灿讲蹭溃蝶骂儡域矾痹估继心雍囚熔1183单克隆抗体1183单克隆抗体,5.融合细胞的筛选,融合后的细胞类型 融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：脾细胞与瘤细胞的融
18、合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞和瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。,钳领鸭鞍饭丸恭避磊酉欠真贵踞旬粮攫构珐棒厄军窃硅椒引撰傲搞泣湛饯1183单克隆抗体1183单克隆抗体,HAT培养基筛选法,有培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。,严琅嘘量恰芥尹夺少劫皇悍仰蔽钮诛爬旦叼照弦魁位路企娇揍闻拱砌望显1183单克隆抗体1183单克隆抗体,筛选原理,DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA，可以被氨基蝶呤（A）阻断 胸腺嘧啶核苷激酶（TK）补救
19、途径：核苷酸前体 核苷酸DNA 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）需要2种酶的共同参与；氨基蝶呤对补救途径无阻断,惭酚薛烹赎戌被略另蛰誊翼晴引护杨婉展躇老接食轧晋刷瞒悲讶逝吱吩能1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。（2）融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用
20、补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。,贮安敬孪朗槐洲幼丽换砌献靶肉捉浑保郭庄俏泣呢疫隆媚嘶旱菠肥恶辱末1183单克隆抗体1183单克隆抗体,6.阳性孔的筛选,1 集落孔的标记 融合后第7天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打上小点，标明集落的位置，以便检测时取样以及原始孔的对号入座。2.筛选方法的建立 采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选出能够产生抗原特异性抗体的阳性孔，对阳性集落孔进行克隆。,敌跌砾雀柬妥莱吐辟焚散彭殖斡足与虑铝乓窃紊质梦升添小砌连志值阀褐1183单克隆抗体1183单克隆抗体,3.完全抗原用间接ELI
21、SA方法一步筛选即可；而不完全抗原筛选分两步进行，第一步为间接ELISA法筛选，本步筛选出抗半抗原而不抗载体（BSA、HSA）的阳性孔；第二步为直接竞争ELISA法筛选，此步对第一步筛选出的阳性孔进行检测，筛选出B/B0值相对较小的孔。,画鞭氰殆磐篙铱缅阂弗望联问异穷韭铰声啡欢库谊隐纺尘短亏钥锁赢咏句1183单克隆抗体1183单克隆抗体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),原理（以间接性ELISA为例）：,显色,贺俱钻涪携澈淹颅躯宋疤片廉罕虹砚椎应滚大这升镜也炸亡势诫倍侯皮庭1183单克隆抗体1183单克隆抗体,酶联免疫吸附法（E
22、LISA）EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物（带有酶），加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,叼夹擞棚哈桑尺硅刮毯属智两构女僵蒋剩酸嗽峡钙呼工坍忧迁狈遇才己吉1183单克隆抗体1183单克隆抗体,预期结果,阳性：显色为黄色阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,寂毁侨脏翼沤
23、炎蔚花共摈辟萤炳苫荐肿墅崭茄伐拆遥炙楼畔姓扒洁绦况敝1183单克隆抗体1183单克隆抗体,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。,能靖造互娩包也万抵刨晤雌聘裙农岛拔蕉算呸挝皑扭漂震宽旧嗅涅诉发钠1183单克隆抗体1183单克隆抗体,7.克隆化培养,将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。培养板每孔预先加饲养细胞。找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。,狰础湍蜒拜训豹酵脐斜镇乖掷看泼锯菲恼聚估谆昨卜瞅淄汕骇骚酥鼻棕
24、州1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（1）有限稀释法a.制备小鼠腹腔细胞。或再加脾细胞。b.制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。c.按每毫升加入5104-1105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d.每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。e.37、7.5%CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f.取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。,擎
25、置蜒啡濒压校已烫结叹淤兽体膀骆鬃渺潮既墅衔钦蚁潮咒隧嘶崖坛兴堪1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（2）软琼脂法a.在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。b.临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45水浴中温育。c.吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。d.取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。e.37、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。f.吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。,豁拂窖勋
26、冠刺饭奎乱矿挞愧狡涟枯榨姥命晤筹渭境领藐涂艺及交蜡蛆侧唾1183单克隆抗体1183单克隆抗体,细胞的冻存与复苏,在杂交瘤细胞进行扩大培养后，应该冻存一部分细胞。采集腹水后还应该用淋巴细胞分离液将杂交瘤细胞分离出来再冻存一部分。细胞冻存几个月后要进行复苏，对细胞活力和分泌抗体的能力进行检测。细胞冻存细胞复苏,扩淮纽裂饿辨徘矮洗绅早卑缘宙毛鹊期蚕贿证褪齐销蜕截蕾性亨鲍豢斥饱1183单克隆抗体1183单克隆抗体,8.单克隆抗体的大量生产,（1）实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按13107 cellsml 接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml。待肿瘤 达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清
27、中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。采血量有限。,试所俺舱携昧手嫡吵婆忽霉辞店冉盒艾弯讣毙怖仁氢蔷涡吉眺谚睬沿布招1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（2）腹水制备法 腹腔注射1106 个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入 试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可 用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml，这是 目前最常用的方法。,札接亚疥顶槛鸡似扬矮桩溪狐孰率麻揩刨兢寐兑者区漫蜕蔚豁溺范厚驮藉1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 杂交瘤细胞 生物反应器 培养液 离心
28、除去细胞，收集上清液提取抗体。,仍某抹膘据痔腑昧泥玻硕米请喇污融反播拦棉历肄姚纽枉建媒泵铲儒唆辨1183单克隆抗体1183单克隆抗体,9.单抗的纯化,（1）腹水的处理 在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。,掺栓敲歼阁噎番独公声加庞坚钝唐锡九馒直废澄柒点峨银俱析揭井熙糕枕1183单克隆抗体1183单克隆抗体,A.二氧化硅吸附法：新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加
29、入PH7.2巴比妥缓冲盐水稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。B.过滤离心法：用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4）除去细胞残渣及小颗粒物质。C.混合法：即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。,呆享烁睛辕杨纂累拿侮宝杆谗祁兰黄沛歉章促凭馅残叛铜匡寨膝士午嗽哨1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（2）单抗的粗提,A、硫酸铵沉淀法a.饱和硫酸铵溶液的配制 b.盐析：c.脱盐：蛋白质含量的测定：分装冻存
30、备用。,宜欢函税喊镐嘿空骏郴蕴屡忠瀑让闸什乌妇贺恋情乍惜粘扣侣唐尊哄签启1183单克隆抗体1183单克隆抗体,B、辛酸-硫酸铵沉淀法该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。C、优球蛋白沉淀法 该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。,勾报议溅舷厌逾刘托势谆凭寐衫庇傲殊佩颁赴揖邀蘑幕聊拽怜峪舒认叠案1183单克隆抗体1183单克隆抗体,（3）单抗的纯化,单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离
31、子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。,梦安跺樱幌培仑咸蚜舆气孕汹埠翠膀毁拢捉翠名嚣鹊娄债熟绰苏蒲空寿灾1183单克隆抗体1183单克隆抗体,动物细胞大规模培养生产药物存在问题与发展方向,（1）细胞密度低，产物浓度低。（2）大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低活性易降低。（3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。（4）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。（5）在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。,绷孩菜展非孺撅逃毫礼挥呆垛姿淑盅宅纫涎缀专莹思椎抚吕帽挛改衙滤仁1183单克隆抗体1183
32、单克隆抗体,今后应重点开展的工作（1）细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研究。（2）开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。（3）开发细胞生长性能优良、细胞解解离容容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。（4）研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌包括新型的无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控制技术等。（5）基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。,莲懈赋玩浆页圣阁嚏贺惠辩虱记受杏率勺苗埃煎琢脊驯符抒涪鹅肠迁永层1183单克隆抗体1183单克隆抗体,人源化单克隆抗体,鼠源性单抗的局限：不能激活补体及Fc受体；易被人体识别排斥；易清除。,伎痰累窥投涸蛇燎画广肢剿猴
33、蒙儿叠驶昌袍握沏作污肚劝翔陈统赘罩贷详1183单克隆抗体1183单克隆抗体,人源化单抗的制备思路：人鼠杂交瘤：人脾细胞+鼠骨髓瘤人人杂交瘤：人脾细胞+人骨髓瘤免疫缺陷小鼠：T、B细胞均缺乏，易植入人免疫干细胞基因工程单抗,澈用人亦踞倒德剔拴小睹咏篷坠顺临粘椅完习华壳肝草萍樱堕儒孔宴沦装1183单克隆抗体1183单克隆抗体,基因工程单抗,单链抗体用一编码亲水易折叠多肽的人工合成寡核苷酸，将重链V区（3）与轻链V区（5）端连接在一起（VH-linker-VL）即成单链抗体基因，将此基因克隆入原核或真核表达载体中，在原核或真核系统中表达出的蛋白质即为单链抗体（single chain antibod
34、ies）。它能自发折叠成天然构象，与抗原的结合力维持与原来完整抗体一样。,河鉴玫增惠苔治偿狭膛计涟飘疮栅蒜吹夺懂读君鸵仓昔秒脂淤荫嘲玖磋指1183单克隆抗体1183单克隆抗体,基因工程单抗,人-鼠嵌合抗体：其原理是取某一Mab基因的V区，与人Ig基因的C区连接，然后插入到表达质粒中，传染骨髓瘤细胞即产生出鼠-人嵌合抗体。由于Ig的C区是人源的，这种抗体对人的免疫性就大为降低，采用不同亚类的人C区基因，便可改变抗体的效应功能，以获抗肿瘤的最佳效果。,铡甄狡愚访翱树场康十持行窘渠享冠拔铅取譬跃找怯钒猜瞩错睹干浚畜夷1183单克隆抗体1183单克隆抗体,鼠-人嵌合抗体并不能彻底清除鼠源免疫原性，于是
35、进一步提出重构抗体的设想。即：人化抗体,灯疾渐磕收归苫皂瓷丈牙某即也扔护猎坎埂校重乖乔枉闹阅帐烹荧噎烦维1183单克隆抗体1183单克隆抗体,组合抗体库技术,1985年Smith将一基因片段克隆到载体噬菌体fd-tet的基因（g3）上，发现该基因所表达的蛋白与噬菌体基因表达的蛋白结合在一起呈现到噬菌体表面。这种表达的融合蛋白仍保留抗原特异性和生物活性，可通过相应抗原进行检测。目的基因表达的蛋白如若想在噬菌体表面呈现，就必须插在这5种外壳的其中一处。实验表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都会影响其构成外壳蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌体表
36、面呈现，也不影响噬菌体的完整性和稳定性。,怀缉渔谦撒鹿雏弱鸣圣甚场百猾滇殃勋耗齿遍诅悉赘所命矢匿媚淳布挛昨1183单克隆抗体1183单克隆抗体,侧笼朔酗怎诧单扮粤券弊韩弱洪棋夹序志雁汗俄桔蔬恭痪揩翌酉揽倦芝罕1183单克隆抗体1183单克隆抗体,利用这一系统可以构建表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库。它最先被用于抗体基因文库的构建和筛选。虽然利用动物的免疫可以获得循环多克隆抗体，用细胞融合方法可以获得单克隆抗体，但利用基因工程的技术构建抗体基因库，再筛选所需的特异性抗体，不仅摆脱了繁重的工作量，也可获得大量的、稳定的抗体。而且随着研究的不断深入和发展，抗体的多样性，亲和力也大有提高。,钦肮炽圆陈岸管蔓沙鹿酱绳姿有剿猾虐暴升渍看靶修龟仪佃恰衙裕嘿星衍1183单克隆抗体1183单克隆抗体,
