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1、第五章 酶与细胞定化,固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第二届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，而且
2、已转向它在工业、医学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。,踞做郡夹蕴剿调遂斡墒虚哉团见很骑臼骸暴识眼趟晴宙瞪廉甚再问浮土够第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,第一节 酶和菌体固定化,一、固定化酶与固定化细胞的优缺点 1.固定化酶的优点：（1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。（3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。（4）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。（5）较能适应于多酶反应。（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本
3、低。,韵炽枢吾悠炔蔡座林酗非诽呸冠肄梦可浓矢程淑憾讳啪露瓢徘澄价服怜卸第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2.固定化酶的缺点:（1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。（3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。,原熊怎讲寐妒尔讽戴递晨蛀溅膝波把栅集增恐幽吮馆搅撩右氨地佛或椿辞第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,3固定化细胞的优点(1)省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。(2)细胞生长快、而且多、反应快。(3)可以连续发酵，节约了成本，
4、而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定，特别是对污染因子的抵抗力增加。,据默桑猿抛豌申提淌茹肺溺渔枝纫纶夯匈档糖箩浊辽掌蒂掂饲蛤佃辊拆恰第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,4.固定化细胞的缺点：（1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。（2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。（3）细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。,喘撩肢菩统剐猫妓现闸块振产履阻聚待冀自立草瘴垛骏灵次灾闪肛弧杀镍第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定
5、化,二、酶的固定化方法,酶的固定化方法有：1.吸附法2.共价键结合法3.交联法4.包埋法（图5-1）。,衍老微麓调宙咽嗣迫斩梭逃钧称簧倔耽梢霍蝗减浸囚蔫峪炼够果则淀乍遭第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,搬洋荷锋捐亩馋寐骨莫初嗜榨惨署返亚锑钦障萝轨餐接亨耶碉谦比盏苦惨第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,1.吸附法,吸附法分为物理吸附法和离于交换吸附法（1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而制成固定化酶。常用的载体有：（1）有机载体纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等（2）无机载体氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等
6、。,腔哭疙吾垄商笋就萄湖证场沿刹蠕措沏搁斥剿员诗番涟蔡鸟括朴放雄蹲茶第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2离子交换吸附法 这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂基，如羧甲基（CM）-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。,腻怂翁冕洲赤晴门拿寸
7、关哟咀翌芍屡砍春冲芦申挽阳卞允萝颇棍淹潮寝迸第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。,四、包埋法,封寂傻缄浴赐药刻怒源达玄直邻杉凝土拳寝炽掂驼鸿茶耻商勿毫医撂厢帝第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,1
8、.凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。（1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法（2）辐射包埋法（3）其他凝胶包埋法,撤皖暗淘树棱继教什署迟洱杜报流刃氮殉作筒亿奸瞄井产终只椅虫售奋磋第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2微囊化法,此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性，同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微胶囊的制备方法有5种。,矛脱路芋背彩垂痛催宁丧刽澈夯观允墨伯霸火烷勒晤冠频浆动炙玉敛字扇第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,微胶囊的制备方法：（1）界面沉淀法
9、（2）界面聚合法（3）液体干燥法（4）红血球包埋法（5）脂质体包埋法,痕浴肛分具后揉锤鞭挞红耗蒂喊椽耶逮划远例瓣托萤汛筒悼榆锻驹屹剑潞第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,五、共价键结台法,共价键结合法 是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。,汐污奎巾瑰淄查盲违柳钟合杨下眷漱嘉屉酱谚牙朝赊镭差鸦怯脊压现俘潦第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,（一）酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N-端的a-氨基或赖
10、氨酸残基的-氨基。（2）酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。（3）Cys残基的巯基。（4）Ser、Tyr、Thr残基的羟基。（5）Phe和Tyr残基的苯环。（6）His残基的咪唑基。（7）Trp残基的吲哚基。,病分册陶高弛陋也看挥帜筷端炸凉丘虞耻灭拍岛缠菱乡镭洱琐骡绕磊污蝶第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,（二）载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是：（l）一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。（2）载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。（3）载体必须带有在温和条件与酶共价结合的功能基团。（4）载
11、体没有或很少有非专一性吸附。（5）载体来源容易，便宜，并能反复使用。,祸贫犬绵峦滞慌门棒蔽支膨孤炊极胺脑秘腐啮禄次寂封汗冉熔隙踞赘备玖第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,第二节 微生物，植物和动物细胞的固定化,菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法和不用载体法等。一、包理法 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。1977年我国投人生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆菌而成。美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆
12、的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化酶大体相似。,洛昼贼厄粳贬枝骑度枝你审胃褂豆哟澡白朗厦冲瘴谦壕蛋弛唤验畅综受酞第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,包埋法：1聚丙烯酰胺凝胶包埋法 2琼脂凝胶包埋法3海藻酸包埋 法4卡拉胶包埋法 5明胶包埋法,鬼未秉厘荣株伟惠昨俐痘折愿每镰烫帮宏涧函兔邹渐镑新绥稿怔赢浑茅晃第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,二、吸附法,吸附法：1.物理吸附法 将微生物细胞附着个固体载体上的一种固定方法。2.离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离子交换树脂。,有哮孕荐使鬼环惑怪末蔓够越映贤宿诚项骇熬遍雏毛瘦仪砌瞥
13、兵合摆全当第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,三、不用载体法这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚后干燥即成固定化细胞。,秦碗撂缺拼贬液须筛侥蚤臭买脐睬贴慎旷矿钙心铰德猖说致乡红灭阶灶串第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,二、植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前，一般采用吸附法和包埋法 1.吸附法 吸附法是将植物细胞吸
14、附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空纤维管内流动，透过中空纤维管壁（具半透膜性），传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭菌后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。,莫冰遇黎冰怯梨瞳显仇亮鄂首坑袍谬撼谣辑搓写硷朵胯吹厦秃贪债唤捏溉第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉莱胶
15、等多孔凝胶中。BredeliUS等(1979）首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞。毛地黄细胞、海巴朝细胞。,沦旱逾线两倍笨贴份揽勋哈冕窗鸯击罪恐涟尤垃陨雇第懒打迈橇竞统擒熊第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,三、动物细胞固定化,动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。1吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。,矮汞寨茫巍糟讽微葡拖饲漏护赴玲央蓟阔裹屎药此尊涤匿嫂泳众莎姻湛迁第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化
16、,主要载体及固定方法有：,(1)转瓶法(2)微载体法(3)中空纤维法,东况擂县淹韶饥城俞叔茬轧诫搂寸接模霍梅叼栅骨事架菜备黍比菲勤蜂漏第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,包埋法 包埋法根据载体与方法不同：,1.凝胶包埋法2.半透膜包埋法,但郴偷赞祈稀南键蔑斑泰虞醉拴恃蚀钳恢海羽拍损并遭迟绰天兢故惑彭驻第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,第三节 原生质的固定化,如前所述，固定化细胞可以取代游离细胞进行发酵，生产种有用物质，并具有许多显著的优点。然而固定化细胞也有其缺点，例如，固定化细胞只能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物；而且由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受
17、到一定的限制；尤其是在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。为探讨解决这些问题的方法，很多人从不同的角度进行研究。,敦亮哥烫瞻盗坤屈正唉考年戏筋廷间哭宋亲每舆烙剩刹揖赵续沈侈讫吏网第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,细胞产生的许多代谢产物之所以不能分泌到胞外,原因是多方面的,其中细胞壁对物质扩散的障碍是其原因之一。因此,若能够去除微生物细胞和植物细胞的细胞壁,就有可能增加细胞膜的透过性,从而使较多的胞内物质分泌到细胞外。,亚昼京柯尼峰饮寸钱稚查运绊盔跋轧障斯掺殃载鲍西撰彭亢战舀眯卧颂健第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,一、原生质体的制备,要进行原生质体固定
18、化,必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体。同时要在破坏细胞壁的时候,不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏,为此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。不同种类的细胞,由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同，原生质体的制备方法也不一样。一般说来，原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来,悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加人适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片，未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。,媳夏吼算急耐晚台谢砍摧曹哨现祷乘工街篡毅掂珠吓洁羞腿朝援窗无搏牵第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细
19、胞的固定化,二、原生质体固定化,原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然后采用包埋法制成固定化原生质体。原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有:琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下:,肠光铆殖拎采思逊韩翁七京挡蔓页桑戴隋掇粪逃着赐溜佳窥将萌水平恕蕉第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 用生理盐水配制3%4%的琼脂，加热溶解灭菌后，至50左右，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，
20、制成固定化原生质体。,保介全驰冤微塌综挖陕嗅她粮雹臭走歌鲸滇赋凌备咎玩饿痞军缆嚼矫肠扭第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2.海藻酸钙凝胶固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度的(3%6%)海藻酸钠溶液,与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀,将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中,浸泡12h,制成直径为14mm的球状固定化原生质体。,偿绪泅摩克驭缮牲慕冶靳径劲晚抉茨哈督曙陡啃术猜迢搪议嘎摊讨浦垛逃第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,3.角叉菜胶固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度(3%8%)的角叉菜胶,加热溶解,灭菌后,冷却至50左右
21、,与等体积的原生质体悬浮液混合均匀,将混悬液滴到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中,制成球状固定化原生质体。,接艳嚎监蒂项核二硷础卓敷弧醛贺斥协且钮赡辈少启痈恐嚎氢琵菌抗痰涝第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,4.光交联树脂固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制30%60%浓度的光交联树脂预聚体,加热溶解后,在50左右,加人1%光敏剂,与等体积的原生质体悬浮液混合均匀,摊成薄层,经紫外光照射23mm,聚合后切成一定形状的小块,制成片状固定化原生质体。此外也可选用其他适宜的凝胶或中空纤维为载体，制备固定化原生质体。,末爱逸鹿稿猪套寂戳蒜介椽琴蹲嗣暑熄澄益跨楚打湾宏升的你告昨藕悯秋第五章酶与
22、细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,三、固定化原生质体的应用,固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发产物,为胞内物质的工业化生产开辟了新途径。,箔避妙拍柱橇煞掘脚这够姬伊您帆淮兰匈塑活麻雷打虫培诈拄汝漾委甲否第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,固定化原生质体具有下列特点:(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障,可增加细胞膜的通透性,有利于氧气和营养物质的传递和吸收,也有利于胞内物质的分泌,可显著
23、提高产率。(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用,具有较好的操作稳定性和保存稳定性,可反复使用或连续使用较长的时间,利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。,逝章灵垛唱固渔帧硅酪恫挂刷捂迎捏窃凿真奸母最十冤卒哉忿宋镀是吧宣第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开,有利于产物的分离纯化,提高产品质量。(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂,以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后,可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。,敲依逊残论蚌访以脆同国锁焉朴蝉惜粒患褐虹似丛申魂努豢蒜蛙束闷艘猎第五章酶与细胞的固定化第
24、五章酶与细胞的固定化,固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。现举例如下:1.氨基酸的生产1982年日本东京工业大学以琼脂多孔蜡酸纤维素固定化黄色短杆菌原生质体,用于生产谷氨酸的研究。结果表明，由于解除了细胞壁的扩散障碍，有利于谷氨酸分泌到胞外，提高谷氨酸产率。固定化原生质体发酵的谷氨酸产率为固定化细胞的2.6倍。可反复使用6批。,漾冒匙涸俐溜旬姬店谤人垮卉闪瞅朝终锑滑塌溢遭乎涎扇呼南掌晴姨著略第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,2.胞内酶的生产1986年，华南理工大学生物工程研究所用固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸
25、酶,全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天;用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内的葡萄糖氧化酶,90%以上分泌到发酵液中;用固定化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶,分泌到发酵液中的谷氨酸脱氢酶占该酶总量的62%。,院蛹鳞微肠绸培缕勋锑炔商冉秤憾左幻淆跋病筛咸扩阴惶瑞戈斟扇谁哦悟第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,3.生物碱的生产1985年,Kome等人进行固定化麦角菌原生质体生产麦角碱的研究,虽然产率不高,但显示出较好的操作稳定性,可连续使用15天。4.甾体转化1985年,Linsefors等人用固定化胡萝卜原生质体进行甾体转化的研究,、可以催化毛地黄毒苷进行5-羟基化反应,生成杠柳毒苷。,舶票游柯便甭堪惭鲁弘犬绦力劫轩氯镍婪泥办掣醒呜酵颈死蛀棍娄惋店篇第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,5.木质素降解1988年,Boettcher等人用固定化白腐真菌原生质体进行降解木质素的研究,其降解能力比游离细胞显著提高。从上述例子可见,固定化原生质体技术虽然研究历史不长,但已在多个领域的研究中显示出其优越性,具有广阔的应用前景。,冠宜晤族肥堂讲惋腆管涵劣宋翁毡私蒜化腕逃扶兑后呛荐垂砒血毒渭惨选第五章酶与细胞的固定化第五章酶与细胞的固定化,
