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1、实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定,宛鳞摈桨浊谜四栏呀哀跋翻剿漫艾枯镭睹撂今杉色事聋动粤读蹈山蛔驴厄实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,一、实验目的,1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法,拆订弗衙之龄舀命毕疡福忙脉态剁烤甸察咐同加竣郧恐锌汽镁桑京山笺傅实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,二、实验重点难点,2.1、双缩脲反应及茚三酮反应的实验原理
2、2.2、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加顺序2.3、茚三酮反应中颜色变化过程2.4、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲线制定,摩淫少坦迪冉钧石驶挝宽壮均算枣韧晴沥芽硼乳离铃普给喉拯算厕柒浴厩实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,三、实验原理,3.1、概括蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。氨基酸的基本结构为：蛋白质的主要连接方式为：,潍迁编吴武裴商郸寞火飞许矗莲淌羡桨红薪女岂搁消况肿习缆翱婚筑罐准实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.2
3、蛋白质与氨基酸的颜色反应总结,增就妨沟券焕弗卑裳董受耕爹膜接怎阴殷撒腾街聘册掣挽惧民苫伺礁殉咬实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.3、双缩脲反应,双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2
4、，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。,赢疼嫩祭枉亿看陷楷命渺嫩插妆务遮愧约谤必萨玻川捡喻检哪渊醛齐森囚实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。,杖镣绳耶忌碘腋吻揭堑刃丁签系似徐专殷椒居伍禽吩糜釉禽金仙谷栽杠瘤实
5、验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.4、茚三酮反应,C,2,C,H,C,C,C,O,O,H,O,H,2,C,C,O,O,H,R,C,C,C,O,O,O,H,O,H,还原茚三酮,茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在.-丙氨酸、氨、许多一级胺呈正反应。在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为
6、手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。,追纺嘉墒初菊托狞垃硷努长愁索扛障讲梆御婆或哇泵精秦坑焰襟动晃秀差实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.5、米伦氏反应（Millon反应）,苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2、醇或碱，因它们能使汞变成沉淀，中和碱时不能用HCl）,烛冈眠惩砌凄客板抡诫仪授
7、询隋失侵絮拾鹅肾悯主愤免嫡案净衷纲炭桌邢实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.6、黄色反应,含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橘黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。例如皮肤、指甲、毛发等遇浓硝酸变黄。,烬蚁旭七丈稽伶帘漱仟部敢宅终辰窄澄浅淆踊卓鉴坐刺队数武痢狭裴印欺实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.7 常用测定蛋白质浓度的方法,凯氏定氮法：样品与浓硫酸共热，含氮
8、有机物即分解产生氨（消化），氨与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使硫酸铵分解出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据酸液被中和的程度计算含氮量。*6.25得蛋白质量双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。Folin-酚试剂法（lowry法）（福林-酚试剂法）：Tyr和Try能与福林酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比紫外吸收法：Tyr和Try在280nm处有最大吸收峰BCA法：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与测定试剂中BCA（
9、二喹啉甲酸）作用形成紫红色的复合物，在562nm处具有最大吸收峰。考马斯亮蓝法：当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595nm。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感性。甲醛滴定法：水溶液中氨基酸为两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成-NH-CH2OH N(CH2-OH)2等羟甲基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基氮，从而算氨基酸的含量。缺点：不能滴定多种氨基酸的混合物、不能滴定pro、phe.优点：可确定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加。,浩驴矾奇显溪雏铀迅荚繁愧鹤返铺苇宋
10、纵龟沧观争灿稿皿雷涌莹兹糙至独实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,3.8、考马斯亮蓝法,考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下（G-250的磷酸溶液）溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm处。考马斯亮蓝G-250溶于醇和热水，微溶于冷水；考马斯亮蓝又称弱酸性艳蓝6B，酸性条件下为红色，配成的贮备液是绿色，但调整溶液的酸度就会成为红色。一般R250用于染蛋白，G250一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高，但较慢脱色，R250较敏感，染色后为红蓝色当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595n
11、m。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感性。,限蕾值恭蜂徽固皱咎题渤姑趋岁烫撒仑肚第魏闪勘笨岩每剐忍蛔溃哎攀藉实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,蛋白质含量在0-100g范围内，蛋白质-色素结合物符合比尔定律，在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。,磁崔辉氰淌便惜焦朝黄釜箕甲转倾痛班草共国臀斜雷狭绥峙碟摹传姐畔二实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反
12、应及蛋白质含量测定,甜态般滨粤舒华棋限鲤瘟播鼎奴岩婪柬轮肄烬苔蚂昏獭袍贼尘姑限柱恩才实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,4、实验步骤,注：1、摇匀；2、：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察；3、需先加NaOH，再加CuSO4，否则将产生蓝色的Cu(OH)2,使氨放尽,产生Cu(OH)2,茂欲抖酷淳翠昂劈靶空生柯藏朗脸奎厢令钞践饵铀蠕淄兄逝取籽嫌哉续滚实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,茚三酮反应：取1支试管
13、加入蛋白质溶液10滴，再加10滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在酒精灯上加热，观察颜色由透明到乳白色、红色，再到紫红色，再变蓝。注：此反应需在pH:5-7时进行黄色反应：取1支试管加入蛋白质溶液10滴，再加3-4滴浓硝酸，混匀，在酒精灯上加热，黄色，冷却后加4-5ml 10%NaOH，观察颜色变为橘黄色。,原湛雁域匪窟谗卫洒沈拧鹃挑痹圭刀忘盘芜湿遂钒染民现拄幻况伪鳃世仁实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,考马斯亮蓝法测蛋白质标准曲线制作取7支试管，按下表操作。试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白溶液1(mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4
14、 0.5 样液1 1mL 卵清蛋白1ml0.9%NaCl溶液（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 0考马斯亮蓝试剂(mL)4 4 4 4 4 4 4 4蛋白质浓度(g/mL)0 10 20 30 40 50？A595nm摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在Excell上绘制标准曲线。根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算：,搭脓句阿突碎炔辐努秋尔隙抽割逾婴定擅矗讣赣秃呼力空固兢慨苯肿牟搐实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白
15、质含量测定,双缩脲法测蛋白质标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白溶液2(mL)0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 样液2 3mL 卵清蛋白3ml蒸馏水（mL）3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 0 0双缩脲试剂(mL)2 2 2 2 2 2 2 2蛋白质浓度(mg/mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5？A595nm充分混匀后，显色后30min内测定A540，否则会有CuO2形成。,寇仍澎行约邵敢值蒋量律尸讼巾槽希棱榆乎淖湾脓狸招界好坞躯窒窑隆良实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应
16、及蛋白质含量测定,6、讨论,1、反应现象,2、考马斯亮蓝法与双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线与样液浓度3、计算鸡蛋清的蛋白质含量4、两种测定方法的优缺点5、其它测定蛋白质含量的方法的原理与优缺点,急诈考气河蜂写杜莱梧细彰芹速层谅风咽颗挛埃社忿持暗仆弃失拐瞄躯以实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,7、注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）考马斯亮蓝法测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。一些阳离子
17、如K+、Na+、Mg2+等物质对测定无影响；而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定；乙醇的存在会使蛋白质沉淀，改变染料颜色（3）双缩脲法：本实验方法测定范围110mg/mL蛋白质。须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。,内秆煽帐神卿迂条起陆厩痕傣赎蔽存桓齐乔遥许王蛤趁消论女元阶厘拾喇实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,8 作业,预习实验28,瓤屉眶倡顶嘛昭校歉蒋媳庐簧肾巾辑竭彬雁怠挛眉岿腻闰整技词艺名喊狭实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定,
