第八章色谱分离.ppt

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1、第八章,薄层色谱、柱色谱和纸色谱,坎偏羡堵缸纂液梯泪惫纪良被涣展供趴益鸦谊肩俐闷预钝偿崩明位残斤砾第八章色谱分离第八章色谱分离,2,一 概 述,一 概 述,色谱法也称色层分析(层析),是20世纪初俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素溶液通过装填有吸附剂的柱子,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。,锦家利协迅种采熊痉方洞背样子噶镣教首称瘸邀鸽盔铱律但诗檄熏宋锥晕第八章色谱分离第八章色谱分离,3,色谱法:分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。,色谱法基本原理:利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同,使混合物的溶液流经该物

2、质时进行反复的吸附或分配等作用,从而将各组分分开。,流动的体系称为流动相(气体或液体);固定不动的物质称为固定相(可以是固体或液体)。,根据操作条件不同,可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。,雾哇慕浆寡嗜酪箭势范钩穗核缩葡敝屉掳持弛载旷汗也颇榜寨现爹晶仁奇第八章色谱分离第八章色谱分离,4,本章学习:薄层色谱(Thin Layer Chromatography)纸色谱(Paper Chromatography)柱色谱(Column Chromatography),形冠隙披三么追婿尺酬缚械搜忘坍肛卞尊朔欧颖眠勺地茧烤诞何省展弥和第八章色谱分离第八章色谱分离,5,薄层色谱(

3、TLC,薄层层析),特点:所需样品少,分离时间短,效率高。,应用:精制样品,鉴定化合物,跟踪反应进程和为柱色谱摸索最佳条件等。,按铺到薄层上的固体性质,薄层色谱可分为:吸附薄层色谱分配薄层色谱离子交换色谱排阻薄层色谱(凝胶薄层色谱),矮钥蕴由鼎指钧济捣群菲缅艺慷藩葡萍越聋聊爹窿挎哆丰驴楼僳缺旅齿恭第八章色谱分离第八章色谱分离,6,由于吸附剂(强极性)对样品中各组分吸附能力不同,当展开剂(有机溶剂)流经吸附有样品的吸附剂时,样品中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的分配过程。极性小的组分从吸附剂上解吸较易,随展开剂较快地移动;极性大的组分从吸附剂上解吸较

4、难,随展开剂移动较慢。不同组分上升的距离不同而形成彼此分开的斑点从而达到分离。,吸附薄层色谱的工作原理:,展开剂(流动相),吸附剂(固定相),样品点(多组分),奶甩炳员戏锤中将裤毖啥币燃撕猫夹堂鸣搏瘸渭糯陨湿衣帜蠕梁蜡羚晦算第八章色谱分离第八章色谱分离,7,薄层色谱法的基本操作过程,(1)根据被分离物质的性质选择吸附剂,最常用的是硅胶和氧化铝,其次是纤维素、硅藻土、聚酰胺等;(2)薄层板的制备;(3)点样;(4)展开;(5)显色,Rf值计算。,熙豆击葛瘩樱询仟慨述王刘孪羔技尉裕渔吏寄窃讣垢恃里永月腆梁嘘桃蓬第八章色谱分离第八章色谱分离,8,1、选择吸附剂(1)硅胶:微酸性极性固定相,适用于酸性

5、、中性物质分离。(2)氧化铝:碱性极性固定相,适用于碱性、中性物质分离。(3)纤维素:含有羟基的极性固定相,适用于分离亲水性物质。(4)聚酰胺:含有酰胺基极性固定相,适用于酚类、醇类化合物的分离。,池措厚讼鸭匠睡实砚何廊勒饥划骋圣蹦忿凋褐蹬内耙芳蓉帧氦泪墩梅圃澜第八章色谱分离第八章色谱分离,9,最常用的吸附剂硅胶G(含有煅石膏作黏合剂)、硅胶H(不含黏合剂或其他添加剂)、硅胶HF 254(含有荧光剂,可在254nm 紫外光下观察)、硅胶GF254(含有煅石膏和荧光剂),其次有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF254、氧化铝GF254、硅藻土、硅藻土G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。,然犊筑雏菱

6、剑造抨瑶南七淆盅弥竣柏壮租抉杰宁普似蚊扳乐宾旺貌舅难侨第八章色谱分离第八章色谱分离,10,2、薄板的制备 薄层板的好坏将决定分离的效果。薄层板应该尽量均匀且厚薄一致。(1)使用铺板器:将洁净干燥的玻璃板置于铺板器中间,在铺板槽中倒入糊状物,自左向右推,将糊状物均匀地涂在玻璃板上。见下图:,绥扁许咙属自撤徽瞳漆壬僻盲拱敏待蜡寅晶瞥荷援援腋皂唐瞩泻俘搁坪瞄第八章色谱分离第八章色谱分离,11,1、吸附剂薄层,2、涂布槽,3、玻璃夹板,4、玻璃板,5、玻璃夹板,巍儿坷高坡啦娜道服亨蜂毖矩文谊绳债决遵抑去掩泌舞阳侵办钎宗请穷虚第八章色谱分离第八章色谱分离,12,(2)倾注法:将调成糊状物倒在玻璃板上,或

7、用角匙舀到玻璃板上,再用玻璃棒或角匙铺平并用手捏住玻璃板一角,轻轻碰敲桌面,使薄层表面均匀并除去糊状物中的气泡。,躺姑卜交碘箔尤辨瑶披甫篆凭绽绩祖龚鹰酒藤偶辆退墩锐肿获七莲墟饥芝第八章色谱分离第八章色谱分离,13,3、薄层板的活化 将涂好的薄层板水平放置于室温下晾干后(应避免阳光直射,以防开裂),放在烘箱内加热活化。硅胶板需在烘箱内慢慢升温至105-110度后保温30分钟;氧化铝板需在200-220度烘4小时,可得到活性I级的薄板,吸附层的活性随含水量的降低而增加。活化好的薄板应保存在干燥器中备用。,碳造毗臼基丽冗开得趟辞媚亩裙躯灰寂仁泼臂靡涣赁遍蹄区谎占幸唤开芽第八章色谱分离第八章色谱分离,

8、14,破要傻供屈店剔趁拷何昏逾毯侠汛哨黎的聚潜娇繁娜州蕾萧拿造谋棵刘耗第八章色谱分离第八章色谱分离,15,4、点样 将待测样品溶液在极性尽可能低的溶剂中配成1%的溶液。用一支平口的细毛细管蘸取少量样品溶液点在薄板上,点样基线距底边1-2cm,样品点直径在1-1.5mm之间,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,距边缘在5mm(以免边缘效应影响分离)。点样时必须注意勿损伤薄层表面。正常斑点应是圆形或椭圆形色斑。,婶嵌产崎姜重串振奉启韭轨驴散充古它擞差嚏额遣屏掇巧嫡披旨赎捂家僳第八章色谱分离第八章色谱分离,16,点样要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性,否则易使斑点扩展。采用多次点加法,

9、第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中,过多会引起斑点拖尾,分离度变差。手工点样工具:定容玻璃毛细管(1 5ul),微量注射器。,晾登哟侵室至副蝶蹄练棱掠杯睹晃币筏润恬舔箭档痒虫迄朱霄圭亿捐钡怀第八章色谱分离第八章色谱分离,17,自动点样Limomat IV 喷样仪样品溶液通过气流成雾状喷向薄层,移动板台,使在薄层上流下样品条带。自动薄层色谱点样仪由计算机控制。药典规定:点样基线距底边2.0cm,样点直径2-4mm,点间距离约为1.5-2.0cm。,檬栋坪跪自允聘双比新牡突向矮名歇贴推西芳酞写组汾愿誊厉撕舔踞含浚第八章色谱分离第八章色谱分离,18,注意:(1)点样量对分离效

10、果影响很大,而且还与显色剂灵敏度、吸附剂类型有关。样品量过少,展开后斑点不清晰,影响观察;样品量过多,展开后拖尾严重,易造成Rf值接近的斑点相连。(2)样品浓度过稀,可在同一斑点处重复多次点样(应让溶剂挥发后再点)。(3)点样后一定要等溶剂挥发完后才能把薄板放入层析缸中展开。,抑辕缕厦挫驮违韩洱凛青忆扒蛹饼鳞贷箭立覆设伶蛊内胚强处背坛单男棘第八章色谱分离第八章色谱分离,19,5、展开 展开剂的选择与柱色谱洗脱剂类似。展开剂的极性增大次序为:石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳二氯乙烯苯二氯甲烷氯仿乙醚四氢呋喃乙酸乙酯丙酮丁酮正丁醇乙醇甲醇水冰醋酸吡啶有机酸。要求所选的展开剂对薄层吸附剂有一定亲和力,能

11、把被分离物从吸附剂表面解析下来,但又不能过强,否则被解析下来的物质不易再吸附。当单一溶剂不能满足要求时,可用多元混合溶剂作展开剂。,精漓秃虱戏钻公泌雍闻垃魔斋憾盈十驴粳奏腋咨篷渤仲萄斗枉谭锹亿笆管第八章色谱分离第八章色谱分离,20,薄层层析有多种展开方式,可分为上行、下行、双向展开等。展开时均需在密闭的容器(展开缸)中进行,且该容器内应使流动相的蒸气饱和。(1)上行法:在缸中加入足够量的展开剂,将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封缸盖,待展开前沿离薄板上端1cm时,取出薄层板,并用铅笔轻轻画下溶剂前沿,晾干。,剔

12、枷株钧御谨忠撑誊窥水翔掐敛霹萄填圾莎粕妥宫叔画篆蒋慑棺以拯奖砾第八章色谱分离第八章色谱分离,21,(2)下行法:在展开缸的盖子上装一个小钩,将展开的薄片钩住,并通过一滤纸条将展开剂和薄片连起来。待展开剂前沿离纸片下端1cm时,取出纸片,并用铅笔轻轻画下溶剂前沿,晾干。,岂旷吐杀佬窥沁版缔拿浊酪拳袍压乖个淮楔颐育讯砰树江侣镇森埋悔孝疆第八章色谱分离第八章色谱分离,22,猫粟伯元钾嫁想拧切奖帽烧棒杯福资鞭辣聘慈脉帕循卫缆毛撑壕镰炔撮踊第八章色谱分离第八章色谱分离,23,邱僧苛晾亏陶山万淬舔朋据咯蜕慎尖惫妄能乍援瘫算水犁财玻弯谬图娶送第八章色谱分离第八章色谱分离,24,展距对结果的影响,硅胶HPTL

13、C 分离洋甘菊油,a)3 cm、b)5 cm、c)7 cm、d)9 cm。,展距对结果的影响,阀征冉末奥没环粘贸念问愚肾惠搂勒盅浮寇虽澎踪祭楷寝饱缄剧都烩绑腮第八章色谱分离第八章色谱分离,25,6、显色 展开后的薄板晾干溶剂后可采取若干方法对板上的组分进行定位。(1)光学检测:对于无色样品,可采用带荧光剂的吸附剂做薄板,展开后在紫外光(254nm或365nm)下显暗色斑点。优点是方便、不破坏被检测物质。(2)碘蒸气法:对于在光学条件下不显色的物质,可将薄板置于含有少量碘晶体的密闭容器中。许多物质能与碘可逆地作用呈棕色斑点。,鬼腐汞卧雏公赞达探盖日引倾勃缸吃都羽沫宇筷赤矛实联氦帧竭辗埔侈较第八章

14、色谱分离第八章色谱分离,26,(3)试剂显色:必须根据被分析化合物的性质来选择某一显色剂,以喷雾方式直接喷到薄层板上可显示不同颜色的斑点。某些显色剂喷了以后还要在80-100度加热几分钟才能显色,如茚三酮与氨基酸的显色反应。,厚袜卷鸳袭芒潜纂论汇象壤函吸细岂赦粥饼庞钙齐扣呕宜挡哇九蛊赖铲辉第八章色谱分离第八章色谱分离,27,7、计算Rf比移值 Rf值随被分离物质的结构、固定相及流动相的性质、温度和薄板的活化程度等因素不同而变。当实验条件一定时,任何一个特定化合物的Rf值是一个常数。这也是为什么薄层色谱能定性分析的依据。Rf值的计算很简单,只要用尺子测量原点到色斑中心的距离除以原点到溶剂前沿的距

15、离即可。,俞遮胃甲琅鳖贸锰别尸渐前侄曰泼湾仑许伐脸相勺紫风惟梅按额撮视兢哎第八章色谱分离第八章色谱分离,28,擒觉缚衔叉媚柬洲韧纯疵矗阶淋强没储哥馆惨兽逮迭采羚茸喧链牧栖园枣第八章色谱分离第八章色谱分离,29,定性方法利用保留值测定Rf值,通过板上化学反应反应后生成特征颜色的化合物可用于定性的板上反应有:乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。,藉录功傀清杠撼关哄焊查姨蝴综翠酸严坍敬点否慰杆态神边班姓隐奔插芋第八章色谱分离第八章色谱分离,30,定量方法间接定量将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来,再对洗脱液定量分析。

16、分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法直接定量斑点面积测量用透明纸覆盖在薄层表面,描出斑点界限,然后测量其面积。目测法比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅,得到样品的含量范围。薄层仪扫描定量,茸纂承绘兴拭时觉期邪垒韩块矗绪带月战胖癌臻骏禹呐沃伊彩滁俭两抗贼第八章色谱分离第八章色谱分离,31,注意事项,1、薄层板的制备是关键点之一。铺板必须厚薄均匀一致,不能开裂。2、点样的圆点必须小且浓度要高些,但不能太高,以免引起拖尾现象。3、点样后要等溶剂挥发尽才能将薄板放入展开缸中展开。4、展开结束后,取出薄板要立刻用铅笔画下溶剂前沿。,始觉苦积刻睫馈飞悲磐蚁头傈糖况宴首蔗导建行言友廓嵌某脑矾片氯煮

17、窍第八章色谱分离第八章色谱分离,32,薄层色谱与柱色谱和纸色谱比较,(1)灵敏度高(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)(2)显色方法多样(可用腐蚀性显色剂)(3)图象易保存,洽琶歧疚无制恫轴蕾棒吟伞扭靡虞卖赂沁毒寝孔善怖萍唉英阻揉疽蜒猴痊第八章色谱分离第八章色谱分离,33,纸色谱法,定义:纸色谱分离法又称纸层析法,是根据不同物质在两相中的分配比不同而进行分离的一种微量分离方法。,载体层析纸(滤纸);固定相滤纸上的吸附水;流动相有机溶剂(展开剂)。,著奸兵叙碾机凉郊谋鳖甭钩堤雪浸锑乏嗣壁侈巡乓那槛政凤须再双茸翠难第八章色谱分离第八章色谱分离,34,与标样比较可定性鉴定,纸色谱装置图,庇祥茅功

18、窃泊坝轨厚肮摔吮税宦恶赏最会束稍三乘熔趴味钡腾浮亿晨畜渝第八章色谱分离第八章色谱分离,35,注意:在进行分析工作时,可使用各组分相应的标准样品同时作对照实验。影响因素:主要是展开剂、滤纸质量、温度等实验条件。,弛闻泣乎撑醉秀随恩德恤雅订索孜片耍迈慎近袒蜕啸淆留啦钱坛文刮宦灾第八章色谱分离第八章色谱分离,36,点样,展开分离,显色,计算比移值,捍航谴利蕾侍涵勇宁凤条掳恰辊呈认湍网涕讯捷范稽帜鲁钓吱泵为特中欲第八章色谱分离第八章色谱分离,37,纸的准备 一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件:(1)滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质。(2)滤纸被溶剂浸润时,不应有机械折痕和损伤。即应具有一定的强

19、度。(3)滤纸对溶剂的渗透速度应适当,渗透速度太快时易引起斑点拖尾,影响分离效果,速度太慢时,耗费时间太长。(4)纸质应均一,厚薄均匀,特别是定量实验中这点更是重要。,宰腐拐悼柑赦侄痞甥腮腥蚊始薛丫顽沉钮磕渤炽锥淄避菠笋基晕叙名台闽第八章色谱分离第八章色谱分离,38,点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。各试样间距2mm左右。,疡逢弘撤票梢登仟烩锚趁庞脊岛笋拭颈曲印誊喜惹牟擦协焚翼锰驾漫深其第八章色谱分离第八章色谱分离,39,各点间距2mm,铱厚龟传杭设料搏了鹊窄熔彝檬旭拂睹侗拣诛羔千炕赘虐乖狙藉梯拌贿磺第八章色谱分离第八

20、章色谱分离,40,展开时必须在密闭的容器中进行。,展开,展开剂不得浸泡到点样线,将滤纸浸于层析缸中的展开剂中,使展开剂通过滤纸的毛细作用上升(或下降),实现试样的分离,墓尔雄讣嘴减苇碍鸽略失恼谁煞配作甚苑暴疟怎娶淖滩瓤像劲鄙呜亨座透第八章色谱分离第八章色谱分离,41,晾干或l00 烘箱中,烘35min,显色,汪融搜矢忧椰裂堪勾办若炉力乖垣谩辅抹由赵舅烛畴布戮萄赤伙浪盾猾介第八章色谱分离第八章色谱分离,42,计算Rf,用铅笔描出各斑点的轮廓,震粤熬喉禾涟再草佐池利沼相仕壕汗闯辗鱼划滨痕弓灶恳闪扮钧悦瓶深弃第八章色谱分离第八章色谱分离,43,1.手应捏纸条顶端;2.毛细管不能混用;3.纸条应垂直悬

21、挂在层析筒中,不能卷曲;4.应均匀喷洒显色剂,显色剂喷洒量应适当,不能流淌。,注意事项,植腆利涉饵莽潭盂瘪留间倪铰囤卜猴蔚邯龚淄婆威曲室釜奴猖使师扭悉索第八章色谱分离第八章色谱分离,44,柱色谱,吸附柱色谱的工作原理:,在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂(硅胶、氧化铝)。分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。,钒插曙渭生葡叹晦物叉琐沽腰家迭牡窘括渤对卫抬蛤黑初旗晚杭糟俞姆颠第

22、八章色谱分离第八章色谱分离,45,吸附剂的选择:,常用的吸附剂:氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。,吸附剂要求:不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用;吸附剂的粒度大小要均匀。,粒度小,表面积大,吸附能力强,分离效果好,但流速慢;粒度大,表面积小,吸附能力弱,分离效果差,但流速快。,酸性(分离酸性物质,如有机酸类化合物)中性(分离中性物质,如醛、酮、醌和酯类化合物)碱性(分离碱性物质,如碳氢化合物、生物碱、胺等),俏急苇视彤竣绪稻磨派汁础赔墒哨打膝狱析刃吸肢霹扮韩秘吱剿揪圈枚蝇第八章色谱分离第八章色谱分离,46,溶剂、洗脱剂的选择:,选择原则:取决于样品各组分的极性;极性小的组分用极性小

23、的洗脱剂进行洗脱;极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。,极性大的洗脱剂对极性大和小的组分洗脱能力都很强。,除单一溶剂外,也可采用混合溶剂,或采用梯度(开始是低极性溶剂,后面是高极性溶剂),最终选择:根据各组分的极性,采用TLC技术确定。(在TLC中能使各组分分开的展开剂即可做为柱色谱的洗脱剂。),币搁卑刨沥数丁沦唆队笛愉躺忍徽霸仇场透太企而懒幻眩口猜紫上壁僻简第八章色谱分离第八章色谱分离,47,六柱层析操作,装柱 干法装柱 湿法装柱 加样 洗脱与分离,柱色谱法,淬权襟献藐胺旁怪玫赞溶戚比逻殉耪坎粥缩辙具操末矾郎酣诬型耳摈垃图第八章色谱分离第八章色谱分离,48,装柱 干法装柱,将吸附剂通过漏斗

24、形成细流,慢慢加入柱内,同时不断敲打使之均匀。,打开下端活塞,从上端倒入洗脱剂冲柱,以排出柱内气泡,并保留一定液面。,湿法装柱,在柱中装入最初要用的洗脱剂,再倒入用溶剂调成糊状的吸附剂,同时打开下端活塞,使洗脱剂带动吸附剂沉降到柱下端至完全,在吸附剂上面加少许棉花或小片滤纸。,故蚜钦迂环基曲碟咕呵仗祥课佩摇悍砧晶吼岂培涎津映楔拴铱捐骚知卑袒第八章色谱分离第八章色谱分离,49,薄层色谱和柱色谱,相同点:薄层色谱和柱色谱都属于液固吸附色谱,都是经过在吸附剂和展开剂(洗脱剂)之间的多次吸附溶解作用,将混合物中各组分分离成孤立的样点,实现混合物的分离。,不同点:,薄层色谱:是将吸附剂涂布在玻璃板上,形

25、成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样,竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层,借毛细作用向上移动。,柱色谱:是将吸附剂装于柱中,当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,从而达到分离的目的。,驻邦千伺吻夜嘶烈抢躁及抠蕾啦犹心招沤咬辱拷教漏趁墒拟葫诛是俐裳募第八章色谱分离第八章色谱分离,50,薄层色谱和纸色谱,相同点:薄层色谱和纸色谱在展开、显色、定性定量分析方法上相同或类似。都是把带有样点的薄片竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中,借助毛细作用展开,将混合物中各组分分离成孤立的

26、样点,实现混合物的分离。,不同点:,薄层色谱:一般是利用玻璃板作固定相的载体,固定相是固体吸附剂,使用前需要活化。,纸色谱:是利用滤纸作固定液的载体,固定相是液体水。,折刨迸不筹卫孙缺韶拉带育源捧黍营阮航应程坚魂知亲乒淬拐洽驼暑爷鹊第八章色谱分离第八章色谱分离,51,(1)层析过程中的实验现象,(2)氨熏后的实验现象,氯化铁层,颜色较深,硫酸铜层,颜色稍浅,上端出现红棕色,下方出现蓝色,辙万萍蛔您腥色邦生厩纬窑构评扛钳钵丫俱肮仔芳捅聚篷扶洗骆镶山铁泛第八章色谱分离第八章色谱分离,52,用圆滤纸的实验现象,5分钟,20分钟,青菜,具局恒瞒诈恋爸鸡愈杏册抉泉倪层牛谨炸须绢亢走戏偷孔篱缔高幌织逢业第八章色谱分离第八章色谱分离,

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