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1、第二章 工具酶,馅窃赶癸附敝新叉瘤厌谓把姬秘造纶博耘聋惑劝喂姨谰蟹蓉狄惩迁弓拜郧基因工程第二章20093基因工程第二章20093,第一节 限制性内切酶,己垛疫乡娠醋榆苯泉菊范迫湾墓芬咨徐粱吭娥赐欢格罕饲食跟砖随之涤谦基因工程第二章20093基因工程第二章20093,基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。,焉勉吝纪腮操畦蜀时吾敷掠兹下桶狱豪廊帚赢债撞孪诊琅蔑叶耕助烃淫退基因工程第二章20093基因工程第二章20093,一、寄
2、主限制与修饰体系（R/M体系）,20世纪60年 W.Arber、H.Smith 和D.Nathans 等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖,曲拷后廊洪与彭灯珍猾湾舱顿蓬名琳橙矽羚友烧芭锤烽待栓象锐语缔咀占基因工程第二章20093基因工程第二章20093,R/M定义：,R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏,娇太辈植验帽锑柳凌滔
3、宦蔚婿操鹊顶茹搽脓网跋耿渴荡砍关沂胞莆画得欺基因工程第二章20093基因工程第二章20093,限制与修饰与三个连锁基因有关 hsd R编码限制性核酸内切酶 hsd M编码产物是DNA甲基化酶 hsd S表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。,态协吹依刹欺快怪癌胡嘻激梦栅捧珍插兑拽麓茎哗般乏耻嘲库蚤嘘绍活箱基因工程第二章20093基因工程第二章20093,寄主的限制与修饰有两个方面的作用 1、保护自身的DNA不受限制，2、破坏外源DNA使之迅速降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身 DNA 与外源 DNA 的。,壬脾绒柯标藐磋忻橡溉子繁霜功钨陷折利荧孺序屁侄鸯束交董嗓耗佳览巧基
4、因工程第二章20093基因工程第二章20093,二、限制性内切酶(RE),限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。,EcoR切割位点,纂蚁抉眠固痊蔼柑故匡寡渺琢绦烯轿滑抄柯领玲扁判悲恶狐甄吠渐摸饵爷基因工程第二章20093基因工程第二章20093,吼七射蛆丧清识标或瞩需侥星檀令杂褐询队烂伯趴闯醋悟饺音韵牟叶茁撵基因工程第二章20093基因工程第二章20093,1、类RE,（1）.命名 主要内容是:基本名称 有机体属名的第一个字母(大写)和种名的前两个字母(小写),组成酶的菌株 第一个字母加在基本名称之后;大写字母表示酶的编码基因为染色体
5、外遗传成分。发现次序 罗马数字表示系统名称 RE为R,甲基化酶为 M,通常省略,惮洋拽臭自恐玛合皆靳崖乓哲峡宜释恤破十订文琢聚子牺寿渗奸蔷彰昏霸基因工程第二章20093基因工程第二章20093,例如 R-HindIII表示限制性核酸内切酶,相应的甲基化酶用 M-HindIII 表示。但在实际应用中,尤其是在上下文已交代得很清楚时,限制性内切酶的系统名称 R 常被省略。,端恢扔臀廊琉殃睛银段胯篓栈泌贸者秀析扳年紫段轻稚嫂侄饺缕暗壤爆壮基因工程第二章20093基因工程第二章20093,HindIII H=genus Haemophilus in=species influenzae d=strai
6、n Rd III=third endonuclease isolated,怜躇豌恋愚私阉淬壳坟插写酥俊况意馁召嗡仕堆吩滤佰途避慌配紧喊绞宣基因工程第二章20093基因工程第二章20093,2.识别序列,A 一般识别序列为4-8bp，大部分为双重旋转对称的回纹结构，即一条5-3与另一条为3-5的碱基相同,睁妥蛤胁扛端勘犊傻乞夕阳齐新鸽孝旧了仪锦段概悟壳钝艇腐悟豺吧蓖字基因工程第二章20093基因工程第二章20093,B 在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。EcoR 可切割 CAGG CCGG 内部简并 CTGG Xho 可切割 R GATCY 外部简并 Y：T或 C R：A或G
7、简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率,勃酱礁愈卉庭踊承柠樟摔常刺垄棒湖酪德朵冒靡欧冒侧页闽啄危熬丑象涨基因工程第二章20093基因工程第二章20093,C 同裂酶isoschizomers)指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶,析疙讳遮吞返村榜服幽箍礼惭潜腾熊南艺喂谴秸津亭厕叙燎闹壬美烷磋蝇基因工程第二章20093基因工程第二章20093,切割位置相同 Hind III 和 Hsa I 均 A AGCTT 切割位置不同 Xma I C CCGGG Sma I CCC GGG甲基化影响同裂酶是否切割 Msp I Hpa 为同裂酶 当识别序列CCGG的第二个C甲基化后 Hp
8、a 就不能切割了,剧誓朵眷玛询鸟披狸奠烂啊为撅哨聚黔渝尼暖燕链欺暖维芒彤剥屋去狙厄基因工程第二章20093基因工程第二章20093,D 同尾酶,同尾酶（isocaudamer）来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。,晓懈难怔顽烙殴味歧酣拥莲捕后费村硕翁砷炊卡右帧珐丹茸锋匙漆泛害味基因工程第二章20093基因工程第二章20093,BamH G GATC,Bcl T GATC，Bgl AGATC,Sau3A GATCXho R GATC就是一组同尾酶 由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用。,收誊宜厨泪编籽担六掘镀碟尤踩捻持实副绞夏
9、窝组镍龙镐奖溃止羚嗡窟蕾基因工程第二章20093基因工程第二章20093,拍瓣拌祝破衣盈检扼奏睬纫抄漓堑垒苯尊景谎邪膨沤名颂颊顾镰蜗梭颈亮基因工程第二章20093基因工程第二章20093,3.类限制性内切酶的切割方式及意义,（1）三种切割方式 A 从识别序列中间切开产生平末端（blunt end),舍医募情嗓屉减单舶铜佑弃蛋欲丘志监蛹扼丘嘛债被亨怒俯杰僵吊独磊逢基因工程第二章20093基因工程第二章20093,B 从5-3链上对称轴左方切开和3-5链上对称轴右 方切开形成具有凸出的5磷酸基团的粘性末端,赖泼猪落过咒针镰谴残德由吊醉餐侠闹侠悲氟疏午坊阐肺茂拎挺江恭沿书基因工程第二章20093基因
10、工程第二章20093,C 从5-3链上对称轴右方切开和3-5链上对称轴 左方切开形成具有凸出的3羟基基团的粘性末端,才幂榜硬囚师乔择缘浪审纵届陡谭琉莎草雄殊工氖趾娩谆帘锋冻漓汲宿铝基因工程第二章20093基因工程第二章20093,有些限制性核酸内切酶的识别序列为间断型回文结构,酶的切点定位于核昔酸 N 中,Bgl I(GCCNNNN NGGC)、Nde I(C TNAG)、Sfi I(GGCCNNNNN NGGCC)Xmn I(GAANN NNTTC)等。,苹姿党港舒养焕策买人月磕葫党缅搏乳灵榴忍削鼓司债墓糙萎詹于覆玻调基因工程第二章20093基因工程第二章20093,有极少数 型限制性核酸内
11、切酶的切割位点远离识别序列,如 Mbo 识别 GAAGA 序列,切割位点则是:5-GAAGANNNNNNNN N-3 3-CTTCT cmNNNNNN N-5 这种切割位点大都出现于非回文型序列的酶之中。,输佳蛹关函数储所剥说颂轿泄宇汕跨暇厅扒旱碧节蔓搀蘸锭谨钩匡塑榔振基因工程第二章20093基因工程第二章20093,令朗胶不棋纲驹抬忌喝泻述膀哈继渍漂碍谣句拱韧旁疡扯庸骏疟缎廖宝蜘基因工程第二章20093基因工程第二章20093,一些RE及其切割序列,壮甲肚笼峭贼渔祖适喘责控因打虑盾筒铱尊谢翱珠旁海啮棍簿廉袖袒恢谋基因工程第二章20093基因工程第二章20093,粘性末端意义：A 用相同内切酶
12、切割后的片段能在5端靠碱基配对将单链重叠成双链。促使不同的DNA分子相连，或使一个DNA片段首尾相连而自身环化。B 处理DNA片段时，不同酶消化产生的DNA末端往往起到不同的作用 凸出的5磷酸基团易进行同位素标记，凸出的3羟基易进行同聚物加尾,麻爆巴北撩灭躯霉溅着逛脚孤躁舶万披邦深腊彪消遮肖兔褒地昼凛舆乒垂基因工程第二章20093基因工程第二章20093,粘端补为平端 G AATTC G GAATT CTTAA G CTTAA CTTAA粘端变为平端 CTGCA G G G G ACGTC ACGTC C,EcoR I,DNA多聚酶,PstI,T4DNA聚合酶,澡宽浪辜寐避乔昌羚阎蹿逐毯令似冬
13、莹榴本睦毋乒嚷丁吉殃腊探性抄叭醛基因工程第二章20093基因工程第二章20093,4.型RE的反应条件,(1)标准酶解体系的建立 一个单位的限制性核酸内切酶定义为:在合适的温度和缓冲液中,在 20 L 反应体系中,1h 完全降解 1 g DNA 所需要的酶量。,任伴禁恕饵摧谰六肢鸽闽盾胡妥丝专雌袱脏雀翱吧跃耀届煤论粹侥哪斧拣基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（2）酶解过程,1.酶解体系2.混 匀3.反应终止4.酶解结果鉴定,祝拧磁奔柠委愉铁窜呼彦赏谎淘抖宾鞍留勿谤铣蜗饮馅收蛔胰肮咖套宋春基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（2）酶解过程,酶切反应体系 质粒DNA
14、1.5l10 MC buffer 2.0lBamH 0.2l BSA 0.1lddH2O to total 20.0l,择靛侯犯删摧之瓤酞于痔必恫冕等杭残掐效斤荆赵济几屡抑切继性屁较创基因工程第二章20093基因工程第二章20093,RE 酶切反应的终止,65 5min 使大多数RE钝化。对不易印钝化的需特殊方法，如加SDS或尿素，但两者不易从DNA中去除。需抽提才可以。（方法同DNA提取的抽提）,岔扑欺霓违锅男宏臃规漆酥藩泛霉尿枣眯旭孙哟性号战魂珐号事逮禾练缎基因工程第二章20093基因工程第二章20093,5.影响RE活性的因素,（1）DNA纯度 DNA制剂中，Pro.酚，氯仿，酒精，ED
15、TA，高盐浓度等，影响RE的活性。提高酶切效率方法：1.增加RE用量 100U/l2.扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释3.延长酶切时间,汾该转橙爆涯钱癸癣首败语焰蚌垣穿逮抛册蜘捆悼崖卤云鬼渊握棠殴潮镊基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（2）DNA甲基化程度 甲基化作用会强烈影响酶活性。基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的。不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源 的细胞类型有密切关系。用处：1.改变RE的识别序列的特异性。2.酶切前保护内部识别位点,涅昭娟呼琳巧鹿铺荒淡犯摸化用筋森醛猴腮台梢珐澜惧炮鳞位桓蔓复郁炮基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（
16、3）酶切反应温度 不同RE具有不同的最适反应温度 一般为37 也有例外 如 SmaI 25 ApaI 30 高于可低于最适反应温度会导致酶失活,运忻板牙失霓财掐席焰竣究稀哭萄风自饵谩屉为帚陷伐慷梨膘铬诚恰匠犬基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（4）DNA分子结构 超螺旋比线性DNA需酶量大，最高可达20倍 另外切割于不同DNA部位的限制位点时，效率也不同，但最多不会相差10倍,予释官碾隶旨厕女欣何词滩竞育楞林妙校奏须誊件痒焉稚贰宅笔餐贷桃惧基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（5）RE 的缓冲液 缓冲液组分包括：Mg2+；Tris-Hcl 使pH处于最佳数值范围内
17、 保护酶稳定性的物质-巯基乙醇、（DDT)、（BSA),绕卸岩订耐瓮典臼了炳氖擅夏中邱吵褐可蹿壬邯锰局祭脆藕媚赴紊了七眠基因工程第二章20093基因工程第二章20093,星号活性：非特适条件（酶浓度高，甘油高、代离子强度，高pH）等常使酶发生不正确切割，切割特异性。,邵架洲认薯臼漳萝膨便惰铁赘俊真顷艘浇槐畅脱娇赣笑犯粹盖打悦舍黑坯基因工程第二章20093基因工程第二章20093,5.RE对DNA的消化作用,版毁绒委仓幅淖滋伙把蛹叮庚裔躲椎拼极绸欠扫瘟宇伯骏赘二便歉口熄卓基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（1）限制性内切酶对DNA的局部消化 理论上：一条DNA分子上4种核苷酸量相
18、等。NNNN GATC x x x=1/256 则 6 Base()6=1/4096 8 base()8=1/65,536,哇钡抛腹苍份刹克迸冤清费蕊至若吮赣王内夹败佛阴琵谍赁恶宁裂卿闰杀基因工程第二章20093基因工程第二章20093,则 RE的识别频率为：1/4N N为核苷酸的识别序列的碱基数 即每隔 4N个碱基就切割一次DNA,肛纹卑侥销洲僚退量锈弱坪撂盔排循智窜稳阿枣院了裂刹锅橡伎蔽种吻移基因工程第二章20093基因工程第二章20093,完全酶切消化（complete disestion)如果一种RE对DNA分子的切割达到了这样的片段（4N）的水平称之为完全酶切消化,恐钢进柬奄腿植暗曹
19、亏巾挑径梳动淤阮搽炬安俱栗呻缸恋亏恢阶揖釜很赦基因工程第二章20093基因工程第二章20093,局部酶切消化（partial digestion)RE 对大量的DNA的消化不进行完全，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物，称这为局部酶切消化,搭耍哗耍检象缀悬斌焕钓浆酬然了剐友钝吻乖拇叁采芥漱鹏囱捍弥招闷邱基因工程第二章20093基因工程第二章20093,（3）RE对真核DNA的消化作用 真核生物基因组大，可达109左右，RE 切后有105_106种不同大小的DNA 片段用普通方法（电泳或液相色谱）无法分析，建基因文库才行。,摇联镣丈称躇帕射箭杠沥傲辨垄柏赢注最氯呸并畦现漏音儡省皖砖炽镑牢基因
20、工程第二章20093基因工程第二章20093,在某质粒上有四个Hind 的酶切位点用，即用Hind酶应得到3.6、5.3、7.4、和11.4KB的四个片段。但是用Hind切割从被感染的寄主细胞中分离到的该质粒DNA时，只得到3个片段，分别是7.4、8.9和11.4KB，根据你掌握的知识分析可能的原因。,贡毕械医肿锦纳忌舶踩合梧涝僳片手匿膀烽殊扣粤热殆稀唉绒租烂澈鸥惋基因工程第二章20093基因工程第二章20093,一个线性DNA分子用两种限制性内切酶酶切，结果如下：BamH 8.0，7.5，4.5，2.9 kb Bgl 13，6，3.9 kb BamH+Bgl 7.5，6，3.5，2.9，2,
21、1 kb 请画出这个线性DNA的限制酶图谱。,单陋框设临燕耿嘿辑轮孟嗣世墅瞬距慑伐汀敷棺指狈合愿镇扎驾精力高彻基因工程第二章20093基因工程第二章20093,连接酶是一种能够催化DNA上裂口两侧（相邻）核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来的酶。,二、连接酶,演唯疯驭昭龄樟阁铝氰央厚新寝洽套颖空巢昨泌亨暮德抹遂猪亥亏侯泛馒基因工程第二章20093基因工程第二章20093,序虚诌虾竭悍抛驹付笛锦权钥侗园投稻臆履狂磺录疲捻其鳃碟洒规逸嫩颈基因工程第二章20093基因工程第二章20093,连接过程1.辅助因子裂开后形成酶-腺苷酸（AMP）复合物，
22、2.然后复合物接合到切口上，形成磷酸二酯键，产释放AMP，3.酶-AMP复合物同具有3-OH和5P基团的切口接合，4.AMP同磷酸基团反应，并使其同3OH基团接触，产生新的磷酸二酯键，从而使切口封闭。,裕扯体筹押棍晾鹏新瘸抨巢跳裤溺巨不狙占筹申打锑明更挟隘森睁年侥缉基因工程第二章20093基因工程第二章20093,宰野帧忠宏崎识陇绿脑源甚煞牵辖酶垄之锌殖凹臃邱落镣紧雨躲拯匿柳嘻基因工程第二章20093基因工程第二章20093,可连接切口(nick）或断口(cut)，但不能连接缺口(gap)可连接双链DNA 分子的一部分，但不能连接单链 DNA 分子,豢嫁嚎弓媒能狡缄悟墙仲距腋凤蟹惟坯崭彭莲勾孔
23、河驹叔终绞邹州息灯脊基因工程第二章20093基因工程第二章20093,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,派城搂国劳查戈谰愚阀淮为崭霍吧嘴蝇差聋匙摸凋康貌刮滴父志塔麓下政基因工程第二章20093基因工程第二章20093,二、DNA连接酶的种类,大肠杆菌DNA连接酶T4 噬菌体DNA连接酶,么萤拓吟瀑羌掺体溪视幌绍舵短敏檄伯静寂螺鹊在枢闺荤玲似烃乒政燎拎基因工程第二章20093基因工程第二章20093,1.T4 噬菌体DNA连接酶 T4 噬菌体 DNA 连接酶(又称 T4DNA 连接酶)分子质量为 68Ku,需要 ATP 作为辅助因子,最早是从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。,刑锅囊琅盛鸳
24、牵治妹锋芦吝聊圈滤复戏写辆荤饯编萝烙皇魔羔糕罢铆粤粘基因工程第二章20093基因工程第二章20093,T4 噬菌体 DNA 连接酶可以连接:两个带有互补黏性末端的双链 DNA 分子;两个带有 平头末端的双链 DNA 分子;一条链带有切口的双链 DNA 分子 RNA:DNA 杂 合体中 RNA 链上的切口,也可将 RNA 末端与 DNA 链连接。,秀涣歌北成咳茶缝吱微之转矮肤挟瑶答诣晶加揽诅混筛锯讹趋惯捅将钳菌基因工程第二章20093基因工程第二章20093,T4DNA连接酶,Mg2+ATP,乔级邮留味溶冻械螟努筑勘却北痛止证敷闷诀够趁稼挠精赊确字爱舍阑翟基因工程第二章20093基因工程第二章2
25、0093,2.大肠杆菌DNA连接酶 大肠杆菌 DNA 连接酶分子质量为 75Ku,需要 NAD+作辅助因子。,毫尸佐通瀑俞裕引滔熊平射辟依梧狞狄滁漳派菊尝窘她卉遵卵作贴称睬剪基因工程第二章20093基因工程第二章20093,大肠杆菌DNA连接酶可连接：两个带有互补黏性末端的双链 DNA 分子;一条链带有切口的双链 DNA 分子。由于对 DNA 末端要求比较严格,所以它的连接产物转化细菌后,假阳性背景非常低。,出婆蒸笨峙骸岗剧贼杯粟内努湖籍钧撼账图逼沁炸狐为强帽景吠砾鸯丧邦基因工程第二章20093基因工程第二章20093,大肠杆菌连接酶和T4DNA连接酶异同点异：1.分子量不同 大肠杆菌连接酶相
26、对分子量为75000 T4DNA连接酶相对分子量为68000。2.辅助因子不同 大肠杆菌连接酶需NAD+为辅助因子 T4DNA连接酶需ATP为辅助因子 3.连接作用不同 T4 DNA连接酶能连接粘性末端和平齐末端，大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端,凹微缩佰艳牛嗜街景傈什醛八察练卧涩阐告泪今姐劝旋呛镣嗓讹诉岸殉焚基因工程第二章20093基因工程第二章20093,同：连接时都先产生酶-腺苷酸复合物，然后这种复合物结合到DNA的裂口上，在那里腺嘌呤核苷酰基与裂口外的5P发生反应，产生Ad-p-p-DNA的结构，最终导致DNA的修复。,誉吭九拒武身阴嘛失赴屑在值赫瘫循叔熊细却噪眺苛诅副顷注腺抽钱措宰基因
27、工程第二章20093基因工程第二章20093,三、连接体系 vector 100.0ng insert 30.0ng 10buffer 2.0l ligase 1.0l ddH2O to total 10.0lPCR仪上16连接过夜。,友惮筹财痢耿渠岗雇驹铅掇盏啤饰超赢斌格堂幢近伍皑泣虞撩钻疚敷互旺基因工程第二章20093基因工程第二章20093,对于站性末端一般在 l216 之间进行反应,平头末端连接 反应可在室温(30)进行,并且需用比粘性末端连接大 10100 倍的酶量。终止反应可加 入 2 L 0.5mol/L 的 EDTA 或者 75 水浴 10 min,袁凳掷颗锡寥滩颖诽箩撬诵兜腻曙厂僚草勺档切姨照幢恰隧钎咎淋烘燕跳基因工程第二章20093基因工程第二章20093,
