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1、中药化学成分提取分离方法,一、中药化学成分的提取,(一)溶剂提取法依据：化学成分的溶解性（极性）关键：提取溶剂的选择溶剂的选择原则：相似相溶的原则，价廉、易得、无毒、安全等。提取方法：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法。,常用提取溶剂性能特点,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法强极性溶剂 溶解范围广 生物碱盐 水 穿透能力强 苷类 煎煮法 易得、安全 糅质 糖类 渗漉法 氨基酸 蛋白质,有些苷类成分的酶解 有些脂溶性成分溶解不完全 水提液易发霉、变质 水溶性杂质多，过滤困难 沸点高，浓缩困难,亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）溶解范围广 除多糖、渗滤法 水溶性杂质溶出少
2、蛋白质外 浸渍法 乙醇 可抑制酶的活性 大多数 回流法 提取液不易发霉、变质 化学成分 连续回流法 大部分可回收利用 均可溶解 但有挥发性、易燃烧,甲醇 溶解特点与乙醇相似，但有毒丙酮 溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，不常于提取溶剂；对色素溶解性好，常用于分离、精制。,亲脂性有机溶剂 对化合物溶解选择性较强 水溶性杂质少、易纯化 连续回流法 挥发性大、易燃烧 回流法有毒、价格昂贵，对提取设备要求高 苷元 穿透力较弱，提取时间长 某些苷类作为提取溶剂不常用 游离生物碱。,乙醚 bp.35，极易燃 氯仿 bp.61、d 1.48，不易燃，毒性大 对生物碱溶解性好 苯 bp.80.1，毒性大 石油
3、醚 沸程3060、6090、90120 脱脂、脱色,（二）水蒸气蒸馏法 适用于挥发性成分（主要 是挥发油）的提取（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（CO2-SFE）,CO2-SFE：以超临界流体作为萃取介质的一种提取新技术。超临界流体：处于临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上，介于气体与液体之间的流体。,特点：具有液体和气体的双重特性，如：密度与液体近似 黏度与气体近似 对很多物质有很强扩散系数是液体 的溶解能力 的100倍中药提取常用的超临界流体：二氧化碳,优点：1.临界温度（Tc=31.4）接近室温,热敏成 分稳定.2.临界压力（Pc=7.37 MPa）不高,易操作.3.本身呈惰性，与化合
4、物不反应.4.价格便宜.,超临界流体萃取中药成分的主要优点：1.可以在接近室温下工作，防止热敏成分 的破坏或逸散。2.萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中 无溶剂残留，对环境无污染。3.提取效率高，节约能耗。,二中药化学成分分离与精制方法,分离依据 分离方法 分离原理或特点 二相萃取法 逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）液-液分配柱色谱 正相色谱和反相色谱 加压液相色谱法 正相色谱和反相色谱 快速色谱 低压液相色谱（LPLC）中压液相色谱（MPLC）高压(效)液相色谱法（HPLC）,分配系数（K）差异,溶解度差异溶剂沉淀法水提醇沉法（水/醇法）除去多糖、蛋
5、白质等水溶性杂质醇提水沉法（醇/水法）除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质醇/醚（丙酮）法 皂苷的纯化（除去脂溶性杂质）酸/碱法 生物碱的分离纯化 碱/酸法 酸性成分（如苷元）的分离纯化试剂沉淀法钙、钡、铅盐沉淀法 酸性成分的分离生物碱沉淀试剂沉淀法 生物碱的分离纯化结晶及重结晶 化合物的进一步精制,溶解度差异,物理吸附（表面吸附）无选择性、吸附 可逆、可快速进行，应用较多 硅胶 极性吸附剂 氧化铝 极性吸附剂 吸附性差别 活性炭 非极性吸附剂 化学吸附 有选择性、吸附牢固或不可 逆、洗脱难，应用较少 半化学吸附 吸附力介于上述二者之间,吸附性差别,碱性氧化铝对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附酸性硅胶对生物
6、碱的吸附聚酰胺（氢键吸附）大孔吸附树脂吸附原理（范德华引力或产生氢键）分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）,吸附性差别,透析法(半透膜膜孔的分子筛作用)凝胶滤过法(三维网状结构的分子筛作用),超滤法(分子大小不同引起的扩散速度的差别)超速离心法(溶质在超速离心作用下沉降性的差别),蛋白质的脱盐精制 蛋白、多糖的分离及 小分子化合物的分离 大分子化合物精制分离 同上,分子大小差别,离子交换树脂法 氨基酸、生物碱、有机酸的分离阳离子交换树脂阴离子交换树脂,离解程度不同,常用色谱分离方法介绍：,吸附色谱吸附剂 分离原理 吸附规律 应 用 硅胶 吸附原理 弱酸性、极性吸附剂 广泛（酸、碱及 化合物
7、极性越大、中性成分均可）吸附能力强（难洗脱）溶剂极性越小，吸附力越强 氧化铝 吸附原理 碱性、极性吸附剂 碱性、中性成分 吸附规律同上（酸性成分与铝络合）活性炭 吸附原理 非极性吸附剂 从稀水溶液中富集微量物质 吸附规律与上相反 脱色（脂溶性色素）,聚酰胺 氢键吸附 酚羟基数目多，吸附力强 能形成分子内氢键者，吸附力下降 黄酮、蒽醌的芳香化程度高 吸附力增强 水洗脱力弱,大孔吸附树脂 吸附原理 非极性化合物易被非极性树脂 吸附-糖与苷的分离分子筛原理在溶剂中溶解度增大，吸附力 下降（从水提液富集苷类）非极性树脂，极性小的溶剂洗脱力强,液-液分配色谱（分配原理）类 型 固定相 流动相 应 用正相
8、色谱 水 BAW系统 极性、中极性物质分离（以PPC为例）反相色谱 ODS甲醇-水 乙腈-水 最广泛，非极性、中极性各类物质分离,加压液相色谱 类 型 压 力（Pa）分离规模 分析用高压液相色谱（HPLC）20.2 105 1mg左右制备用高压液相色谱（HPLC）5mg中压液相色谱(MPLC)5.0520.2 105 100mg低压液相色谱(LPLC)10mg,葡聚糖凝胶色谱 类 型 原 理 溶胀溶剂 应 用葡聚糖凝胶 分子筛 水 多糖、多肽、（大小）蛋白质分离 羟丙基 分子筛 水、极性 适于不同类型葡聚糖凝胶（糖苷）有机溶剂 吸附原理 或二者的混合溶剂（苷元）化合物分离,离子交换吸附树脂 树
9、脂类型 原 理 应 用阳离子交换树脂 离子交换 从酸水溶液中吸附碱性 成分（生物碱）强酸性（R-SO3-H+）阳离子 除去酸性、中性成分弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂 离子交换 从碱水溶液中吸附酸性 成分（有机酸）强碱性（RN+(CH3)3CI-）阴离子 除去碱性、中性成分弱碱性(伯、仲、叔胺),三、结构研究,化合物纯度的判定方法1结晶均匀、一致。2熔点明确、敏锐（0.51.0）3TLC(PPC):三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。,（二）四大光谱在结构测定中的应用,紫外 可见光谱（UV-VIS）共轭体系特征分子中电子跃迁（从基态至激发
10、态）。n-*、-*跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm）,200nm 400 700nm,紫外区（UV）可见区（VIS）,应用：推断化合物的骨架类型 共轭系统。取代基团的推断。如加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、排列方式）用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）。,红外光谱（IR）,分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。,4000 3600 3000 1500 1000 625cm-1,特征频率区 指纹区,特征官能团的鉴别 化合物真伪的鉴别,羟基（酚羟基、醇羟基）36003200 cm-1
11、 游离羟基 3600 cm-1 氢键缔合羟基 34003200 cm-1 羰基 16001800 cm-1酮 1710 cm-1酯17101735 cm-1芳环 1600、1580、1500cm-1 有23个峰 双键 16201680 cm-1,两个化合物完全相同的条件 1、特征区完全吻合 2、指纹区也需完全一致,1H-NMR（核磁共振氢谱）:信息参数：化学位移（）、峰面积、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常数（）,（1）化学位移（ppm）:与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云密度）有关电子云密度大，处于高场，值小电子云密度小，处于高场，值大,0.9-C-CH3,1.8-C=C-CH3
12、,2.1-COCH3,3.0-NCH3,3.7-OCH3,11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0,-COOH,-CHO,Ar-H,-C=C-H,常见结构的化学位移大致范围（要求熟记）,(,(ppm),推断化合物的结构（含1H核基团的结构）,（二）峰面积:磁等同质子的数目 用积分曲线面积（高度）表示（三）峰裂分及偶和常数:,磁不等同两个或两组1H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分,符合 n+1 规律(n=磁等同质子的数目),用偶合常数（J）表示,峰裂分的数目,峰裂分的距离,不同系统偶合常数(J Hz)大小,s 单峰 d 双峰 t 三重峰 q 四重峰 m 多重
13、峰,芳环 J邻610Hz J间 03Hz J对01Hz 双键 J顺711 Hz J反1218 Hz 饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小 与两个氢原子之间的立体夹角有关,=60 J=24 Hz=180 J=910 Hz 环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数 Jaa 1013Hz(=180)Jae 25Hz(=60)Jee 25Hz(=60),1H-NMR核磁共振辅助技术：,（1）重氢(D2O)交换 推断活泼质子（羟基）的存在与否（2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。（3）溶剂位移：苯诱导位
14、移 由于溶剂分子（苯）的接近，对化合物将发生不同的屏蔽及去屏蔽作用，使质子化学位移发生变化的现象。,13C-NMR（核磁共振碳谱）：,FT-NMR:即脉冲傅里叶变换核磁共振。其装置原理为采用强的脉冲照射使分子中所有的13C 核同时发生共振，生成在驰豫期内表现为指数形式衰减的正弦波信号（自由诱导衰减；FID）经傅里叶变换即成为正常的NMR 信号。,随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，13C信号将不断增强，噪音则越来越弱。经过若干次的扫描及累加计算，最后即得到一张好的NMR谱。由于该装置的出现及计算机的引入，才使得13C-NMR用于有机化合物结构研究成为可能。信息参数：化学位移（C）、异核偶
15、合常数（JCH）、驰豫时间（T1）,(1)化学位移：大致范围(C）0-200ppm,不同 13C 核C大小与13C 核所处的化学环境（周围电子云密度）有关,用于13C 核类型的推断,(C ppm),150220(c=o),200 150 100 50 0,c=c Ar,5080(c-o),饱和碳原子（060）,主要结构13C 核C的大致范围(要求熟记),常用13C-NMR测定技术及其特征：,(1)质子宽带去偶（BBO）:也叫全氢去偶（COM）.噪音去偶.,采用宽频电磁辐射照射所有1H核使之饱和后测得的13C-NMR谱（即去掉所有氢核对碳核的偶合影响）。,特征：图谱简化，每个碳原子都为单峰，互不
16、重叠。方便于判断碳信号的化学位移。伯、仲、叔碳峰增强，季碳为弱峰（照射1H核产生NOE效应）无法区别碳上连接的1H核数目。,（2）偏共振去偶：（此法现已基本上被DEPT所替代）,仅保留直接与碳原子相连1H核对碳的偶合J 1CH（即去掉氢核对碳核的远程偶合J 2CH J 3CH）,伯（-CH3)表现为 四重峰（q）仲（-CH2-)三重峰(t)叔（-CH-)双峰(d)季（-C-）单峰(s),碳核（伯、仲、叔、季）类型的判断,（3）DEPT(无畸变极化转移增强法)：（为13C-NMR谱的一种常规测定方法）,通过改变照射1 H核的脉冲宽度（或设定不同的驰豫时间）使不同类型13C信号在谱图上呈单峰，并分
17、别呈现正向峰或倒置峰,脉冲宽度 峰的特征=450 CH3 CH2 CH(代表正向峰)=900 CH=1350 CH3 CH CH2（代表倒置峰）,可用于区别伯（CH3）、仲（CH2）、叔（CH）碳信号与质子宽带去偶谱比较，还可以确定季碳（-C-）信号,二维核磁共振谱（2D-NMR谱）,质谱（MS）:1确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确到小数点后三位）,计算分子式。2提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离子峰可以确定A-环,B-环的取代模式。3与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。4依裂解特征及碎片离子 推定或复核未知化合物分子的部分结构。,质谱主要离子源的电离
18、方式及特点：,电子轰击质谱（EI-MS）：目前常用。,但对于热敏成分及难于气化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）大分子物质（多糖、肽类）难以气化,测不到分子离子峰亦无法测得分子量,电离新方法（样品不必加热 气化而直接电离）,化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定,解决措施,(1)场解析质谱 FD-MS(2)快原子轰击质谱 FAB-MS(3)化学电离质谱 CI-MS(4)电喷雾电离质谱 ESI-MS(5)基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)(6)场致电离(FI-MS)(7)串联质谱（MS-MS）,中药化学成分提取分离鉴别一般方法思考题：,1何谓有效成分及有
19、效部位，二者有何区别？2中药化学成分二次代谢产物的生物合成途径 有哪些？其合成的化合物包括哪些类型？3中药化学成分的主要结构类型及性能特点。4中药化学成分提取的方法都有哪些？,5二氧化碳超临界流体萃取法提取中药化学 成分的特点及适用范围。6简述溶剂提取法的关键及选择溶剂的依据。7色谱技术在中药化学成分研究中有何应用。8何谓亲水性有机溶剂，它们在化学成分提取 方面有何特点。,9 何谓亲脂性有机溶剂，它们在化学成分提取方面有何特点？10水作为常用的提取溶剂，在化学成分提取方面的特点如何？11两相溶剂萃取法的分离依据为何?怎样选择萃取溶剂？12何谓系统溶剂分离法，它在中药化学成分研究方面有何意义？,
20、13何谓铅盐沉淀法，其分离特点如何？14简述水提醇沉法和醇提水沉法在中药 化学成分提取分离方面有何异同？15简述碱提酸沉法和酸提碱沉法在中药 化学成分取分离方面有何异同？16聚酰胺色谱的分离原理及在化学成分 分离方面的特点？,17比较硅胶与氧化铝在化学成分鉴别方面 的特点如何？18离子交换树脂包括那些类型，在化学成分分离方面有何特点？19大孔吸附树脂在化学成分的分离、纯化方面有何特点？20葡聚糖凝胶色谱的分离原理及适用范围？,21简述结晶法分离、精制化学成分的 工艺流程并指出其关键所在？22单体化合物纯度判断的一般方法？23四大光谱在结构测定中的应用特点？24核磁共振氢谱在结构测定方面能提供 的信息参数有哪些，代表的意义如何？,
