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1、天然药物化学,天然药物化学的研究内容，发展历史 天然药物化学成分的提取分离方法 天然药物化学成分的结构研究方法,第一章 总 论,中药=天然药物？,药物-用于治疗和预防疾病的物质。按来源可分为天然药物、化学合成药物和生物药物 中药-广义的概念，包括传统中药、民间药（中草药）和民族药传统中药是指在全国范围内广泛使用，并作为商品在中药市场流通，载于中医药典籍，以传统中医药理论阐述药理作用并指导临床应用、有独特的理论体系和使用形式，加工炮制比较规范的天然药物及其加工品。,什么是天然药物？,天然药物人类在自然界中发现并可直接供药用的植物、动物或矿物，以及基本不改变其物理、化学属性的加工品。“中药”、“草
2、药”和“民族药”除极少数（如铅丹等）为人工合成药外，绝大多数均同天然药物范畴。,天然药物包含了中药，但并不等于是中药。,第一节 绪 论,天然药物化学：是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的学科。研究内容:涉及各类天然药物化学成分（生理活性成分）的结构特点、理化性质、提取分离、结构鉴定和必要的结构改造；还涉及中药有效成分的生源途径等。,天然药物化学在新药研发中的地位,药理、毒理作用,一定的剂型,质量标准,临床前新药,天然药物化学,有效部位或有效成分,药理学,药剂学,药物分析学,药物化学,一、天然药物的来源天然药物是药物的一个重要的组成部分。天然药物来自植物、动物、矿物、微生物，以及海洋
3、中所含的生物资源等，其中绝大部分为植物药。现在，运用在酶、受体、细胞等分子水平乃至基因调控建立起来的新的生物活性测试体系进行广泛筛选，将会发现更多的新的天然药物。,第一节 绪 论,二、天然药物的物质基础 天然药物之所以能够防病治病，其物质基础在于所含的有效成分：有效成分:具有一定生物活性的单体化合物，能用结构式表示，具有一定的物理常数。无效成分：与有效成分共存的其他成分。杂质：一般指蛋白质、多糖、淀粉、树脂、叶绿素、纤维素等。,第一节 绪 论,第一节 绪 论,有效部位：在天然药物中，常将含有一种主要有效成分或一组结构相近的有效成分的提取或分离部分，称为有效部位。尚未提纯的单体化合物或含有有效成
4、分的混合物。（如总生物碱、总皂苷或总黄酮等）有效部位群：含有两类或两类以上有效部位的中药提取或分离部分。,三、天然药物化学的发展离不开现代科学技术的进步。,吗啡 利血平(鸦片中成分，止痛)（蛇木中成分，降压）,第一节 绪 论,微量物质 水溶性物质 不稳定物质 海洋生理活性物质 生物体内源性生理活性物质,第一节 绪 论,研究方向及发展趋势,目的-从中发现新的化合物或者新的骨架类型,四、天然药物化学的发展前景 近几十年来，随着对外开放方针的贯彻执行，大大地推动了我国科学界与国外同行之间的学术交流及人员交往。天然药物化学是药学及化学领域中与国外学者交往最为频繁，学术交流量最活跃的学科之一。目前，我国
5、天然药物化学研究工作的步伐已经大大加快，研究水平也有很大提高，大体上接近于发达国家的水平。,第一节 绪 论,第二节 生物合成,生物合成 是天然药物化学学科中一个重要的领域。了解生物合成的有关知识，不仅对天然化合物进行结构分类或推测天然化合物的结构有帮助，而且对植物化学、分类学以及仿生合成等学科的发展有着重要的理论指导意义，并且对采用组织培养方法进行物质生产也有实际指导意义。,一、一次代谢及二次代谢,（一）一次代谢过程及一次代谢产物,糖类通过代谢产生维持植物机体生命活动不可缺少的物质：三磷酸腺苷（ATP）、辅酶I（NADPH）以及丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、赤藓糖-4-磷酸、核糖等。,第二
6、节 生物合成,一、一次代谢及二次代谢,（一）一次代谢过程及一次代谢产物,上述过程几乎存在于所有的绿色植物中，是对维持植物生命活动不可缺少的过程，习惯上称之为一次代谢过程。对植物机体生命活动不可缺少的糖、蛋白质、脂质、核酸等称为一次代谢产物。（Primary metabolites）,第二节 生物合成,一、一次代谢及二次代谢,（二）二次代谢过程及二次代谢产物,在特定条件下，以一些重要的一次代谢产物作为原料或前体，又进一步经历不同的代谢过程，生成如生物碱、萜类等化合物。因为这一过程并非在所有的植物中都能发生，对维持植物生命活动来说又不起重要作用，故称之为二次代谢过程。黄酮类、生物碱、萜类等化合物称
7、为二次代谢产物。二次代谢产物是天然药物化学的主要研究对象。,第二节 生物合成,二、主要生物合成途径,从自然界中得到的化合物总数很多，其结构千变万化。,常见的基本单位大概有以下几种类型：,C2单位(醋酸单位):如脂肪酸、酚类、苯醌等聚酮类化合物。C5单位(异戊烯单位)：如萜类、甾体等。C6单位：如香豆素、木质素等苯丙素类化合物。氨基酸单位：如生物碱类化合物。复合单位：由上述单位复合构成。,第二节 生物合成,（一）醋酸丙二酸途径（AA-MA途径）,生成：脂肪酸、酚类、蒽酮类化合物,脂肪酸类:,乙酰辅酶A 丙二酸单酰辅酶A,丙酰辅酶A,异丁酰辅酶A-甲基丁酰辅酶A 甲基丙二酸单酰辅酶A,偶数饱和脂肪
8、酸,奇数饱和脂肪酸,支链脂肪酸,缩合,缩合,缩合,还原,还原,还原,二、主要生物合成途径,第二节 生物合成,二、主要生物合成途径,（一）醋酸丙二酸途径（AA-MA途径）,2.酚类,乙酰辅酶A,缩合,聚酮（中间体）,环合,各种酚类,特点：芳环上的含氧取代基（-OH，-OCH3）多互为间位。,第二节 生物合成,二、主要生物合成途径,（一）醋酸丙二酸途径（AA-MA途径）,3.蒽酮类,聚酮类化合物可以根据分子结构中醋酸单位的数目，分别命名为聚戊酮类，聚己酮类，聚庚酮类等。,聚戊酮类,聚己酮类,聚庚酮类,第二节 生物合成,（二）甲戊二羟酸途径（MVA途径）,二、主要生物合成途径,萜类的生物合成基源：,
9、生物体内真正的异戊烯单位为焦磷酸二甲烯丙酯（DMAPP）及其异构体焦磷酸异戊烯酯（IPP），它们均由甲戊二羟酸（MVA）变化而来。,各种焦磷酸酯,对应的萜类,反式角鲨烯,三萜及甾体类,第二节 生物合成,（三）桂皮酸及莽草酸途径,二、主要生物合成途径,生成：C6-C3 骨架：苯丙素、香豆素、木质素、木脂体(苯丙素类的二聚和多聚体)C6-C3-C6骨架：黄酮类,C6-C3骨架均由苯丙氨酸经苯丙氨酸脱氨酶脱去氨后生成的桂皮酸而来。此外，与丙二酸单酰辅酶A结合，可生成二氢黄酮类化合物（C6-C3-C6）。两分子的苯丙素类通过-位聚合，则可得到木质素类化合物。,生源途径：,第二节 生物合成,（四）氨基酸
10、途径(amino acid pathway),二、主要生物合成途径,生成：生物碱类成分,作为生物碱前体的氨基酸：脂肪族：鸟氨酸，赖氨酸（来自TCA循环及解糖途径中形成的-酮酸经还原氨化后生成）芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（来自莽草酸途径）,第二节 生物合成,（五）复合途径,二、主要生物合成途径,天然化合物均来自2个以上不同的生物合成途径，即复合生物合成途径。常见的复合生物合成途径：醋酸-丙二酸 与 桂皮酸途径 醋酸-丙二酸 与 甲戊二羟酸途径 氨基酸 与 甲戊二羟酸途径 氨基酸 与 醋酸-丙二酸途径 氨基酸 与 桂皮酸途径,第二节 生物合成,组织培养：在组织培养过程中加入关键的前体物质，可
11、以提高目的物质的收率。如在进行人参组织培养时，为了提高皂苷的含量，加入了不同的生物合成前体物质。结果表明：加入醋酸、香叶醇、反式角鲨烯时皂苷的含量增加并不明显；但加入甲戊二羟酸及金合欢醇时，皂苷的含量增加了两倍。,二、主要生物合成途径,第二节 生物合成,第三节 提取与分离,天然药物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提取、分离工作开始的。在进行提取之前，应对所用的药材进行如下的考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文献，以充分了解和利用前人的经验。（同一品种其含成分含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不同而有变化）,一、中草药有效成分的提取,提取是研究天然产物
12、的一个重要步骤，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。,溶剂提取法的提取原理：根据化合物在极性相似的溶剂中有较好的溶解性即“相似者相溶”这一原理进行的。溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。,选择溶剂的原则：选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（通称为杂质）的性质三个方面。,对于提取溶剂的要求：对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小，或反之；溶剂不能与所提取成分发生化学反应，若反应应当可逆；要经济易得，具有一定的安全性；沸点适中、便于回收和反复使
13、用。,一、中草药有效成分的提取,天然产物的极性大体可分为三类：极性（亲水性）、非极性（亲脂性）、中等极性（即亲水又亲脂）。亲脂性成分：萜类、甾体、脂环、芳香族成分，可选用氯仿、乙醚、石油醚等非极性溶剂。亲水性成分：糖苷、氨基酸等，可选用水、含水醇等极性溶剂。酸性、碱性及两性化合物：根据存在状态（游离型或解离型）。可选用不同PH值的溶剂。,一、中草药有效成分的提取,系统溶剂提取法：是研究天然药物成分的常用的初步提取分离方法。用极性从低到高的溶剂依次提取，一般顺序是：石油醚苯乙醚 氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水。本法的缺点：由于各成分之间的助溶作用，同一类成分往往也会分散在邻近的几个部位中，这一
14、现象较为普遍发生。虽然如此，但系统溶剂法仍是研究成分不明的天然药物最常用的方法。,一、中草药有效成分的提取,影响提取因素：,1.选择合适的溶剂和方法,2.药材的粉碎度 提取过程中，药材细胞组织中的成分和溶剂间产生扩散、渗透、溶解等物理作用。药材粉碎得越细，中药粉末的表面积越大，提取效率高，但粉碎过细，则表面吸附作用也增强，反而影响扩散速度，降低了提取效率，另一方面，杂质的提取量也增高。一般情况下，用有机溶剂提取时，以过20目筛为宜。用水提取时，则用粗粉或薄片。,一、中草药有效成分的提取,3.温度 一般来讲，热提取效率高，但杂质多，冷提杂质少，效率低。加热温度不宜超过100。在5060的条件下进
15、行提取保持较好的提取率，又不使过多的杂质溶出。,4.时间和提取次数 药材中有效成分随着提取时间的延长而出量增大，直到药材细胞内外有效成分浓度达到平衡为止。一般情况下，用水加热煮时以每次12小时为宜，进行23次。,一、中草药有效成分的提取,一、中草药有效成分的提取,溶剂提取法的分类,1.浸渍法2.渗漉法3.煎煮法4.回流体取法5.连续回流提取法,超临界流体：一物质处于临界温度（Tc）与临界压力（Pc）以上的状态下，形成的既非液体又非气体的单一相态时，称为超临界流体。,特点：流体密度近似液体，粘度于气体相似，扩散力比液体大，介电常数随压力增大而增加，渗透性优于液体。比液体溶剂有更佳的溶解力，有利于
16、溶质的萃取。,一、中草药有效成分的提取,6.超临界流体萃取技术,二氧化碳的优点：1）不残留有机溶剂、萃取速度快、收率高，安全不易燃烧及化学性质稳定。2）萃取温度较低，适用于对热不稳定物质的提取。3）适于对极性较大和分子量较大物质的萃取。4）萃取介质可循环利用，无毒，成本低。5）可与其他色谱技术联用如IR、MS联用，可高效快速的分析中药及其制剂中的有效成分。,一、中草药有效成分的提取,6.超临界流体萃取技术,一、中草药有效成分的提取,6.超临界流体萃取技术,超临界萃取的局限性：1）对脂溶性成分溶解能力强，对水溶性成分溶解能力弱。2）设备造价高，设备折旧费比例大。3）更换产品时清洗设备较困难。,一
17、、中草药有效成分的提取,7.超声波提取技术,采用超声波辅助提取溶剂进行提取的方法。超声波是指频率为20千赫50兆赫左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体(介质)来进行传播。超声波在传递过程中形成许多小空穴，这些小空穴瞬间闭合，可形成几千个大气压的压力，同时局部温度可达到千度以上，这种现象叫做空化现象，从而使固体样品迅速破裂，使溶液能渗透到药材的细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶媒。,1）无需高温。不破坏中药材中某些具有热不稳定，易水解或氧化特性的药效成份。（2）常压萃取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。（3）萃取效率高。萃取充分，萃取量是传统方法的二倍以上。（4）适用性广，绝大
18、多数的中药材各类成份均可超声萃取。（5）超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质（如极性）关系不大。因此，可供选择的萃取溶剂种类多。（6）减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗。（7）药材原料处理量大，且杂质少，有效成分易于分离、净化。（8）萃取工艺成本低，综合经济效益显著。,一、中草药有效成分的提取,7.超声波提取技术,二、中草药有效成分的分离与精制,（一）根据物质溶解度的差别进行分离,上述方法得到的是混合物，需要进行进一步的分离与精制。,1.利用温度不同引起溶解度的改变进行分离 结晶及重结晶操作。原理：待要分离的物质在某一溶剂中热时溶解度大，冷时溶解度小，对杂质
19、而言，冷热都不溶或冷热都易溶。,（一）根据物质溶解度的差别进行分离,2.在溶液中加入一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部 分物质沉淀析出，达到分离的目的 水/醇法除去多糖、蛋白质、淀粉、无机盐等水溶性杂质。醇/水法除去脂溶性的油脂、树脂、叶绿素等水不溶性杂质。醇/丙酮法用于皂苷类成分的精制。醇/乙醚法因皂苷类在醇中溶解度大，而在乙醚中溶解度小沉淀析出，脂溶性的树脂类留在母液中。,二、中草药有效成分的分离与精制,3.酸性、碱性及两性化合物 通过加入酸、碱以调节溶液PH值改变分子的存在状态，从而改变溶解度而达到分离的目的。酸/碱法：用酸水提取生物碱成盐溶于水中加入碱游离沉淀析出。碱/酸法：黄酮、蒽
20、醌、酚类等酸性成分的提取。调PH等电点：蛋白质的提取。,二、中草药有效成分的分离与精制,（一）根据物质溶解度的差别进行分离,4.试剂沉淀法 酸性或碱性化合物通过加入某种沉淀试剂，使之生成水不溶性的盐类而沉淀。酸性化合物（-COOH）：与钙、钡、铅等生成水不溶性盐产生沉淀。碱性化合物（生物碱）：与苦味酸、苦酮酸等有机酸生成水不溶性盐沉淀；与磷钼酸、磷钨酸等无机酸生成水不溶性盐沉淀。,（一）根据物质溶解度的差别进行分离,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,常见的有简单的液-液萃取法、反流分布法（CCD）、液滴逆流色谱（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC
21、）、气液分配色谱（GC/GLC）等。,1.液-液萃取与分配系数K值 原理：利用混合物中各成分在两种互不相溶溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。根据分配定律，化合物在一定的温度和压力下，溶解在两个同时存在的互不相溶的溶剂里，达到平衡后，该化合物在两相中浓度的比是一个常数，称为分配系数K值。,二、中草药有效成分的分离与精制,各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率就越高。K=CU/CL,举例：A、B两种溶质在CHCl3/H2O中进行分配，如A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比为V CHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上的溶质A将分配在上相
22、溶剂（水）中，不到10%的A分配到下相溶剂（氯仿）中。同样的道理，溶质B分配将与A相反。,1.液-液萃取与分配系数K值,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,定义：分离因子可定义为A、B 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。如上例，则其分离因子=KA/KB，即KA=10；KB=0.1；=KA/KB=10/0.1=100 一般，100时，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；但10010时,则须萃取10-12次；2时，要想实现基本分离，须作100次以上的萃取才成。1时，则KAKB。意味着两者性质极其相近，用分配无法实现分离。,2.分离难易与分离因子,（二
23、）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,二、中草药有效成分的分离与精制,对酸性、碱性及两性有机化合物来讲，分配比还受溶剂系统PH影响，因为PH变化可以改变它们的存在状态（游离型或离解型）从而影响在溶剂系统中的分配比。例：,3.分配比与PH,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,HA+H2O,A-+H3O+,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,离解(离子型)游离(分子型)PH PKa+2 PH PKa 2,一般的，PH12时，酸性物质呈离解状态、碱性物质则呈非离解状态。,3.分配比与PH,4.逆流分溶法（C
24、CD）优点:条件温和、试样容易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离。缺点:试样极性过大或过小，或受浓度、温度影响过大不适用。5.液-液萃取与纸色谱 纸色谱的原理与液-液萃取基本相同。=Rfa(1-Rfb)/Rfb(1-Rfa)式中Rfa Rfb 可以利用纸色谱选择设计液-液萃取的最佳方案。,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,二、中草药有效成分的分离与精制,6.液-液分配柱色谱 原理：将两相溶液中的一相涂覆在硅胶等多孔性载体（支持剂）上作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一种溶剂（流动相）冲洗色谱柱，使物质在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断地进行动态
25、分配而得以分离。此过程在一根柱子上进行所以称之为液液分配柱色谱。,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,载体：有硅胶、硅藻上、纤维素粉正相色谱：固定相：水、缓冲液 流动相：氯仿、醋酸乙酯、丁醇适合分离水溶性或极性较大的成分：生物碱类、苷类、糖、有机酸。用流动相洗脱时，极性小的成分先被洗脱。反相色谱：固定相：石油醚、异三十烷、石蜡油 流动相：水、甲醇适合分离脂溶性化合物：高级脂肪酸、油脂、游离甾体。当用流动相洗脱时，极性大的成分先被洗下来。,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,6.液-液分配柱色谱,加压液相柱色
26、谱 为了提高分液速度，缩短分离时间，在加压条件下进行分离，加压液相色谱用的载体多为颗粒直径很小，机械强度与比表面积比一般色谱用的硅胶大的球形微粒，按所加的压力不同可分为：快速色谱（FLC）2个气压，分离范围10mg-1g 低压液相色谱(LPLC)20个气压，分离范围ug-10mg,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,加压液相色谱配有高灵敏度的检测器，自动扫描，分部收集的装置，用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。中低压柱：不超过6个气压，采用Merck公司生产的Lobar柱（C18-十八烷基-反相色谱），分离规模大（可以达到g量级）且分离效果好，分离
27、速度快，操作简便，分离大量样品时可以将几根柱子串联使用，可以提高分离效果。用过的柱子可以用甲醇洗反复使用。,二、中草药有效成分的分离与精制,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,原理：利用混合物中各成分对吸附剂的吸附能力不同而达到分离，其中固-液吸附用得最多，分为物理吸附，化学吸附及半化学吸附。,物理吸附（Physical adsorption）属于表面吸附，由溶液的分子(含溶质与溶剂)与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用而产生的吸附现象。特点：无选择性，吸附与解吸是可逆的，快速进行 吸附剂：Silica gel;a
28、lumina;active coal 硅胶 氧化铝 活性炭,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,化学吸附：chemical adsorption 酸性物质（如黄酮等酚酸类）对碱性吸附剂（氧化铝）或碱性物质（如生物碱）对酸性吸附剂（硅胶）的吸附。特点：有选择性，吸附牢固，难以洗脱。半化学吸附：semi-chemical adsorption 聚酰胺对黄酮、醌类成分的吸附，主要是聚酰胺中的酰胺键与酚-OH、醌式C=O形成氢键而产生吸附，这种吸附力比较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,1.物理吸附的基
29、本规律相似者易于吸附 吸附过程中的三大要素：吸附剂、溶质（待要分离的成分）、溶剂 硅胶、氧化铝均为极性吸附剂，具有如下特点：(1)对极性物质具有较强的吸附力。(2)溶剂的极性越弱，吸附剂对溶质的吸附力越强。(3)被吸附剂吸附的溶质，当加入强极性溶剂时被洗脱下来。活性炭：非极性吸附剂，对非极性物质有较强的吸附力。在水中对溶质的吸附力强，而在有机溶剂中比较弱，洗脱样品时，洗脱溶剂的洗脱能力随溶剂极性的降低而增强。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,2.极性及其强弱判断 极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。极性用以表示分子中电荷不对称的程度，并主要与偶极距、极化度
30、、介电常数等有关。(1)官能团的极性强弱顺序:R-COOH Ar-OH H2O R-OH R-NH2、R-NH-R、R-N-R R R-CO-N-R R R-CHO R-CO-R R-CO-OR R-O-R R-X R-H,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,(2)化合物极性与官能团的种类、数目及排列方式有关 氨基酸分子结构中具有正电基团（NH3）+，又有负电基团（-COOH）极性很强。高级脂肪酸虽然有强极性基团-COOH，但因由长链烃基所组成，故极性很弱（如硬脂酸在水中几乎不溶）。酸性、碱性及两性化合物的极性强弱及吸附能力主要由存在的状态所决定（游离型为非极性
31、，解离型为极性）。,2.极性及其强弱判断,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,(3)溶剂的极性根据介电常数（）的大小来判断 常用溶剂介点常数,由大到小 乙酸 水 甲醇 乙醇 丙酮 乙酸乙脂 氯仿 乙醚（无水）苯 己烷,2.极性及其强弱判断,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,3.简单吸附法进行物质的浓缩与精制 在物质的精制过程中，如结晶、重结晶过程中加入活性炭进行脱色、脱臭。但要注意对水溶性色素，活性炭脱色不一定能收到良好的效果。在大量稀水溶液中浓缩微量物质时，可用简单吸附法。方法：在稀水溶液中分次加入活性炭收集活性炭用有机溶剂提
32、取回收样品。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,4.吸附柱色谱用于物质的分离 在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用的最多。操作时需要注意的问题。（1）吸附剂与样品量的比例：3060：1 极性小，难以分离的样品：100200：1 色谱柱长度与内径比例：1520：1 吸附剂的粒度：100目，难以分离的样品可采用200300目。粒度太细，谱带容易扩散，可采用加压色谱。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,（2）样品与吸附剂的装柱 吸附剂选用极性小的溶剂装柱，样品同样以湿法装柱。如果样品在极性小的溶剂中溶解度小，则改用极性大的溶剂溶解后，再
33、用不到装柱量1/20的吸附剂拌匀，于60下加热挥散溶剂，研细后再小心铺在吸附剂柱上。,4.吸附柱色谱用于物质的分离,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,4.吸附柱色谱用于物质的分离,（3）洗脱用溶剂的极性应逐步增加 往往采用梯度洗脱，实践中多用混合溶剂，一般混合溶剂中强极性溶剂的影响比较大。不可随意将极性差别很大的两种溶剂混合使用。对于极性较大的成分常用氯仿-甲醇，按不同比例梯度洗脱，对比较容易洗脱的极性小的成分，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,4.吸附柱色谱用于物质的分离,（4）为避免发生化
34、学吸附：酸性物质的分离选用硅胶、碱性物质的分离则选用氧化铝为好。碱性物质用硅胶分离时：在洗脱溶剂中加入碱性物质（氨、吡啶、二乙胺等）；酸性物质用氧化铝分离时：洗脱剂中加入醋酸等。（5）在TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统，为柱色谱的最佳洗脱溶剂系统。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,5.聚酰胺吸附色谱Polyamide chromatography,聚酰胺吸附色谱属于氢键吸附。对于极性物质和非极性物质都适用，但主要适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,聚酰胺的吸附性质与吸附原理:聚酰胺是由己二酸和己二胺聚合而成的高分子聚合物。不溶于水及其它常
35、用的有机溶剂，对碱稳定，对无机酸的稳定性较差，可溶于浓HCl、冰醋酸、甲酸。由于分子中含有酰胺羰基及游离胺基，在水溶液中能与含有酚羟基以及羰基的化合物通过氢键结合而被吸附，从而与不含上述基团的化合物分离。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,吸附规律：（含水溶剂中）形成氢键的基团数目越多，吸附能力越强 易形成分子内氢键者，吸附相应的减弱 分子中芳香化程度高，吸附作用增强 氢键缔合都在溶液中进行，所以存在溶质与吸附剂、溶液与吸附剂的竞争问题。一般酚类、醌类等成分与聚酰胺形成氢键的能力在水中最强，在含水醇中随着醇浓度的提高相应的减弱，在高浓度的醇和有机溶剂中几乎不能
36、缔合。,5.聚酰胺吸附色谱Polyamide chromatography,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,操作：用水装柱,样品也尽可能的做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提高醇的浓度。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力为：水甲醇（乙醇）丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,聚酰胺色谱的应用：因分离效果好，吸附容量大，并且吸附可逆，特别适合于酚类、黄酮类成分的制备分离。此外，也用于生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离。因对鞣质吸附特别强，近乎不可逆，所以在提取液中除鞣质时常使用聚酰胺。,5.聚酰胺吸附色谱Polyamide
37、 chromatography,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,白色球形颗粒状，理化性质稳定。不溶于酸、碱及有机溶剂中，在天然化合物的分离与富集工作中广泛使用。（1）大孔吸附树脂的吸附原理：吸附性和分子筛性原理相结合，其吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质。（2）影响吸附的因素：1）吸附剂表面性质的影响：比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键等。一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性树脂易在水中吸附极性物质。,6.大孔吸附树脂,2）被吸附化合物结构的影响：分子量大、极性小的化合物与非极性树脂吸附作用强，易形成
38、氢键的化合物易被吸附。3）洗脱剂的影响：通常洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强。4）PH的影响：碱性物质一般在碱性溶液中吸附，在酸性溶液中解吸；酸性物质一般在酸性溶液中吸附，在碱性溶液中解吸。5）温度的影响：大孔树脂的吸附是一种物理吸附，低温不利于其吸附。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,6.大孔吸附树脂,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,6.大孔吸附树脂,（3）大孔吸附树脂的预处理与再生 市售的大孔吸附树脂中含有未聚合的单体、脂肪醇、分散剂和防腐剂等。使用前必须经过处理。其方法是用乙醇湿法装柱，用乙醇或丙酮在柱上清洗，当流出的
39、乙醇液与水混合不呈现白色乳浊现象后，用大量的蒸馏水洗去乙醇，即可使用。树脂的再生通常能够用有机溶剂来实现，乙醇最为常用。,二、中草药有效成分的分离与精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,6.大孔吸附树脂,（4）洗脱液的选择 根据吸附作用强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。对非极性大孔吸附树脂来说，洗脱液极性越小，洗脱能力越强。对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说，选用极性较大的溶剂为宜。,（5）大孔吸附树脂的应用 苷与糖类的分离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,天然有机物的分子大小不同，表现出
40、不同的分子量，故可以根据分子量的大小进行分离。常用的方法有：透析法:利用半透膜的膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉胶)凝胶滤过法：利用凝胶的三维网状结构。超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。超速离心法：利用溶质在超速离心引起的作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,一.凝胶滤过法1.原理：凝胶滤过法（gel filtration）是利用分子筛分离物质的方法。所用载体葡聚糖凝胶在水中不溶解，但遇水后膨胀成具有三维空间结构的球形颗粒。当加入样品混合物，用同
41、一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能渗入凝胶颗粒内部，故只在颗粒间隙移动，并随溶剂一起先从柱底流出，小分子因能自由地渗入到凝胶内部，通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，后流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不一样，所以在经历一段时间流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小的顺序先后流出并得到分离。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,2.凝胶的种类与性质,常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex-G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。(1)Sephadex-G 由平均分子量一定的葡聚糖与交联剂（如环氧氯丙烷
42、）交联聚合而成，生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂数量越多，网孔越紧密，孔径越小，交联度越高，吸水膨胀也越小，反之，交联度越低，网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号按交联度大小分类，并以吸水量多少来表示。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,(2)Sephadex-LH-20 为Sephadex-G25经羟丙基化处理后得到的产物OH-OCH2CH2CH2OH，虽然羟基数一样，但碳原子数增加，不仅具有亲水性，也有一定程度的亲脂性。因此不仅可以在水中应用，也可在极性有机溶剂或与水组成的混合溶剂中膨胀，所以可用来分离水溶性成分和非极
43、性成分。,2.凝胶的种类与性质,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,3.凝胶的处理及再生,Sephadex LH-20 价格较贵。用过的凝胶可以反复再生使用多次，物质的洗脱过程也就是再生的过程。暂时不使用时可用水洗 含水醇洗 醇洗，最后浸泡在醇溶液中贮存于磨口瓶中。长期不用时可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，6080干燥后保存。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,二、膜分离技术,1.原理：以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力时，原料侧组分选择性的透过膜，以达到分离、提纯的目的。,2.特点：无相变，适
44、用于对热敏感性物质的分离、浓缩；不消耗有机溶媒，缩短生产周期，减少有效成分的损失；分离选择性高，适用范围广；可实现连续化和自动化操作，满足中药现代化生产的要求。,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,3.分离膜的类型,（1）微滤膜（0.1m）：用于截留颗粒物和液体的澄清及大部分细菌的去除。（2）超滤膜（10100nm）：可截留分子量在几千至数十万的大分子，可除去病菌、热原、胶体、蛋白等大分子化合物。（3）纳滤膜（110nm）：介于反渗透与超滤之间，可分离除去分子量为3001000的小分子物质。（4）反渗透膜（1nm）：从水溶液中去除无机盐及小分子物质。,4.膜分离
45、技术在中药提取分离研究中的应用,二、中草药有效成分的分离与精制,（四）根据物质分子大小差别进行分离,（1）用于提取中药有效成分（2）用于制备中药注射剂及大输液（3）用于制备中药口服液（4）用于制备药酒等其他中药制剂,二、中草药有效成分的分离与精制,（五）根据物质解离度不同进行分离(Ion Exchange Chromatography),天然有机化合物中，具有酸性，碱性及两性基团的分子，在水中多呈解离状态，可以用离子交换法或电泳技术分离。,二、中草药有效成分的分离与精制,（五）根据物质解离度不同进行分离(Ion Exchange Chromatography),1.离子交换法分离物质的原理 离
46、子交换法系以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而具有可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。,二、中草药有效成分的分离与精制,（五）根据物质解离度不同进行分离,（1）母核部分：由苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构，网孔的大小用交联度量表示。交联度越大，则网空越小，在水中越不易膨胀。（2）离子交换基团部分：阳离子交换基团：强酸性SO3H；弱酸性COO H 主要用于生物碱的分离阴离子交换基团：强碱性N+
47、(CH3)3Cl-；弱碱性NH2 NH N 主要用于酚性物质和氨基酸的分离,2.离子交换树脂的结构及性质,二、中草药有效成分的分离与精制,（五）根据物质解离度不同进行分离(Ion Exchange Chromatography),（1）用于不同电荷离子的分离 在分离、追踪有效部位时很有用途。提取液通过强酸性阳离子和强碱性阴离子交换树脂，可以将提取物分成中性化合物、酸性化合物、碱性化合物和两性化合物。（2）用于相同电荷离子的分离 如生物碱的分离，利用碱性强弱不同，采用弱酸性树脂可分离，但分离效果不好。,3.离子交换法的应用,第四节 结构研究法,结构研究是天然药物化学的一项重要的研究内容。合成西药
48、：原料已知，反应条件一定时，事先可以预测得到产物的结构。中药化学成分：未知因素很多，对于微量物质难以采用化学方法确定结构，主要靠波谱分析的方法解决。,一、化合物的纯度检查,检查纯度的方法：外观、颜色、形态是否均一.测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等.如果可能是已知物，用已知结构的对照品进行对 照测定或测定它们的共熔点等.薄层色谱、纸色谱（三种展开系统均呈单一斑点）气相色谱、高效液相色谱.,二、结构研究的主要程序,1.初步推断化合物类型(1)注意观察试样在提取、分离过程中的行为。(2)测定其有关理化常数，如不同PH、不同溶剂中的溶解度及色谱行为、灼烧试验、化学定性反应等。(3)结
49、合文献调研。2.测定分子式，计算不饱和度 分子式测定可采用下列方法：(1)元素定量分析配合分子量测定。(2)同位丰度比法。(3)HR-MS。,对未知天然化合物的结构研究程序,3.确定分子中含有的官能团，或结构片断，或基本骨架(1)官能团定性及定量分析。(2)测定并解析化合物的有关谱学数据，如UV、IR、MS、1H-NMR及13C-NMR。(3)结合文献调研。4.推断并确定分子的平面结构(1)综合分析波谱数据及官能团定性、定量分析结果。(2)与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、衍生物制备或人工合成）。,二、结构研究的主要程序,对未知天然化合物的结构研究程序,二、结构研究的主要程序,对未知天
50、然化合物的结构研究程序,5.推断并确定分子的主体结构（构型、构象）常用方法：(1)测定CD或ORD谱。(2)测定NOE谱或2D-NMR谱。(3)进行X射线衍射分析。(4)进行人工合成。,三、结构研究中采用的主要方法,（一）确定分子式，计算不饱和度,1.元素定量分析配合分子量测定 有机化合物的元素大多由C、H、O、N等组成，对组成元素的种类和比例的分析，可以通过元素分析的方法确定。分子量的测定方法目前最常用的是质谱法。2.同位素丰度比法 有机化合物的主要元素均由相对丰度比一定的同位素组成，且质量相差12。3.高分辨质谱法（HR-MS）可将物质的质量精确测定到小数点后3位，通过比较精确质量可区分分
