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1、精品论文推荐洋葱核仁的超微结构动态变化特征和 rRNA 转录1尚广彬 施寒清 王爽 王丽丽 郝水 焦明大东北师范大学 细胞与遗传研究所 吉林 长春 130024E-mail: jiaomd536 摘要：以洋葱为材料对细胞周期中核仁的结构的动态变化进行了追踪，发现在常规电镜 下 S 期的核仁的表面与 G1、G2 相比出现了大量毛状突起并通过毛状突起加强了与核仁 周边染色质的联系，这种现象持续到 S 与 G2 的过渡时期，结合 NAMAUr DNA 特异性染 色，柠檬酸铽 RNA 特异性染色，对这种现象进行了分析，认为这种核仁表面出现大量毛 状突起现象是 DNA 进行复制期间，核仁在常规电镜下的一
2、个明显特征。柠檬酸铽 RNA 特异性染色显示单链 RNA 分布于 DFC 及 GC 区，FC 中未见有分布，说明 DFC 是 rRNA 进 行转录的区域。关键词： 核仁， FC， DFC， DNA， ssRNA1.引言核仁是真核生物细胞的 rRNA 合成加工和核糖体装配的场所。核仁的超微结构主要有三 种基本结构组分：FC、DFC 和 GC。核仁内 rDNA 的分布、转录定位、rRNA 前体的加工及核糖 体的装配、核仁的蛋白质组学等都是细胞研究中的重要问题和方面。1.2.3.4 关于 rRNA 基因 的转录位点是在 FC 还是 DFC，到目前为止还存在争议5.6。核仁的发生是与细胞分裂周期密 切
3、相关的，由于核仁是一功能结构，真核细胞的增殖主要以有丝分裂为主，存在核仁的解体、 装配及重建和生理功能表达等事件，这本身就体现了核仁是一高度动态结构 1，5 。关于核 仁的发生的研究主要证据来至荧光共聚焦显微镜附带使用电子显微镜，主要是以免疫细胞化 学手段标记核仁蛋白来完成 7. 8。关于由电子显微镜水平研究核仁发生的系统工作报道还很 少。通过荧光共聚焦显微镜，可以对核仁的发生进行活细胞水平上整体地研究，但是由于荧 光共聚焦显微镜的分辨力有限，不能对核仁的细微结构进行分析。借助电子显微镜可以对核 仁的超微结构进行观察、分析和研究，通过电子显微镜系统地研究核仁的周期与功能有重要 意义，可以深入地
4、揭示核仁的结构的动态变化与功能的关系。由于核仁的结构变化是与核仁 中的 DNA、RNA 和与 DNA 复制、rRNA 转录与加工有关的酶等蛋白质活动密切相关，因此从 DNA、 RNA 和蛋白质三个角度来揭示核仁的动态变化特征有重要意义。关于核仁中 rRNA 的转录起 始位点的争议可能与研究者采用的标记新合成的 RNA 的方法有关，特别是在使用 5-Br-U 进 行标记时的结果在文献上得出的结论存在分歧9.10.11.12.13.14，有专家认为原因是复杂的6。我 们首次采用柠檬酸铽 RNA 特异性染色法，直接标记单链 RNA（ssRNA）研究了在细胞周期中 核仁内 ssRNA 的分布，并通过与
5、 DNA 特异性染色和常规电镜方法相对照分析了 rRNA 的转录 位点问题。1 本课题得到高等学校博士学科点专项基金资助（项目号：20040200003）- 6 -精品论文推荐2. 材料和方法实验材料高等植物洋葱（Allium cepa），取其根尖分生组织为实验材料。实验方法常规电子显微镜方法：材料以戊二醛、锇酸固定，乙醇丙酮系列脱水，Epon-812 包埋。 NAMAUr DNA 特异性染色法：详细步骤见陶伟（2003）文献15 。柠檬酸铽 RNA 特异性染色法：样品以 4%的多聚甲醛+2.5%戊二醛固定 2 小时，以 Epon812 包埋，步骤详见文献16。染色：取超薄切片厚度为 6090
6、nm(NAMAUr DNA 特异性染色 80120nm)，常规电镜 方法以醋酸铀-柠檬酸铅染色，其他两种方法染色按文献步骤进行。Hitachti-600 透射电子 显微镜，加速电压 75kv 观察并照相。3. 结果与分析图 16 是常规电子显微镜方法照片,其中图 1、2 为 S 期，图 3 为 S 与 G2 的过渡时期， 图 4 为 G1 期，图 5 为典型 G2 期，图 6 为前期。在这些图中可见核仁中的 FC、DFC 结构都很 清晰，但是 S 期和 S 与 G2 的过渡时期的核仁的表面与 G1、G2、前期相比出现了毛状突起现 象，核仁通过毛状突起强化了与核仁周边染色质的联系（图 13），而
7、由图 4、5、6 来看核 仁与其周边染色质之间有一较明显的空白地带，只有少数连接点。图 710 为 NAMAUr DNA 特异性染色结果。由图 7、10 来看 G1、G2 期的细胞核仁 与其周边染色质有多处连接，这反映了核仁内染色质与其周边染色质处于相连的关系。由图8 可见，S 期由于 DNA 复制，DNA 的双链解链进行复制，染色质变得疏松，显得细碎化， 可以见到核仁与核仁外染色质的连接点增多。图 9 为 S 期与 G2 期的过渡时期，可见变得疏 松的染色质已部分开始集缩，核仁与其周边染色质仍有较多的联系。NAMAUr DNA 特异性染色也显示了核仁中的 DNA 分布，而 FC、DFC 中的
8、 DNA 有些代表了 rDNA。图 7 为 G1 期细胞，细胞有二个核仁，可见 FC 中存在 DNA，DFC 中也 有 DNA 分布，DFC 中的 DNA 着色较浅。图 8 为典型 S 期细胞，可见 FC、DFC 中都有 DNA 分布，FC 中的 DNA 较集缩，而 DFC 中的 DNA 呈弥散状态，FC 中有的 DNA 中又有一部 分相对更集缩，这可能是异质性 FC 的一些 DNA。图 9 为 S 期与 G2 期的过渡时期，核仁外 DNA 已部分集缩，但是仍然比较细碎化。此细胞核仁内 FC 中存在的是较集缩的 DNA，DFC 中的 DNA 呈弥散状态。图 10 为典型 G2 期，核仁外染色质
9、 DNA 比较规则，大小趋于一致。 核仁中同样存在较集缩和较弥散的 DNA，FC 中的 DNA 较集缩，DFC 中的 DNA 呈弥散状 态。此核仁中存在一些着色较深的 DNA，由于不处于 FC 中可能是伸入核仁中的染色质。 在这个核仁中亦可见一些弥散型 DNA 分布于 FC 和 DFC 之外的区域图 1114 为柠檬酸铽 RNA 特异性染色结果，由于 RNA 转录时，刚合成的 RNA 链是很 短的，未形成二级结构，因此核仁内的一些 ssRNA 代表了新合成的 rRNA。由图中可见无精品论文推荐图 1、2 为 S 期核仁 常规电镜照片 图 1 核仁有一核仁腔隙。核仁的表面伸出许多毛状突起，强化了
10、与核仁周边染色质的联系。图 3 细胞处于 S 与 G2 的过度时期，常规电镜照片。可见一核仁腔隙，核仁 表面仍有较多的毛状突起。图 5 G2 常规电镜照片。核仁表面与核仁周 边染色质间有一明显的空白地带。图 4 细胞处于 G1 期，常规电镜照片。可见核仁表面与核仁周边染色质间有清晰 的空白地带。图 6 前期的早期，常规电镜照片。核仁内 FC、 DFC 结构仍清晰，核仁表面与核仁周边染色 质间有一明显的空白地带。图 7 NAMAUr DNA 染色 G1 核仁内 FC 中 DNA 较集缩, DFC 中 DNA 较弥散, 核仁与其周边染色质有多处连接点。图 8、9 NAMAUr DNA 染色。核仁内
11、 FC 如存在 DNA 则较集缩，DFC 中存在较弥 散的 DNA。图 8 S 期染色质 DNA 细碎化，核仁与其周边染色质有多处连接。图 9 S 与 G2 的过渡时期染色质的集缩程度提高，核仁与其周边染色质有多处连接。论是 G1、G2 期，还是 S 期，核仁中都有 ssRNA 存在，而且主要分布于 DFC 及 DFC 之外 的 GC 等区域，在 FC 中未见分布。由此可见 rRNA 的转录应发生于 DFC 中，FC 不是 rRNA 的转录位点，S 期核仁内 DNA 的复制并未对 rRNA 的合成产生明显影响4. 讨论核仁是 rRNA 转录、加工和核糖体装配的场所。在细胞周期中，S 期是 DN
12、A 复制期， 核仁内的 DNA 也要进行复制。原核生物如 E . coli 复制、转录和翻译是耦联的，而真核生 物这三个步骤在时间和空间上是分开的，复制和转录处于同一间隔内，即在细胞核中进行。 DNA 复制是一个复杂的网络过程，有多种与复制有关的酶参加。17.18.19 由 ssRNA 特异性染 色结果来看在 DNA 复制期 rRNA 的转录并未停止；由于用 NAMAUr DNA 特异性染色显精品论文推荐期核仁则与其周边染色质的联系较少（一般通过核仁通道联系，结果未列出）。因此在常规图 10 NAMAUr DNA 染色，G2。染色质 DNA 处 于集缩状态，核仁与其周边染色质有多处连接。图 1
13、114 柠檬酸铽 RNA 特异性染色：ssRNA。图 11、12 为 S 期，图 13 为 G1，图14 为 G2。可见 ssRNA 分布于 DFC、GC，FC 中未见有 ssRNA 分布。电镜下 S 期、S 与 G2 过渡时期，即 DNA 复制期，核仁表面通过毛状突起表现的与其周边示无论是 S、G1、G2 核仁都与其周边染色质有较多的联系，而在常规电镜下 G1、G2 染色 质的较多联系应与 DNA 复制事件有关。由于 DNA 特异性染色显示 G1、G2 核仁与其周边 染色质的联系，在常规电镜下并未观察到，因此 DNA 复制和 DNA 加倍并未对核仁与其周 边染色质的联系状态产生明显影响。由
14、ssRNA 特异性染色结果来看，在 S、G1 和 G2 期核 仁中 RNA 的转录和分布没有明显变化。因此在常规电镜下复制期细胞的核仁表现出的通过 毛边与核仁周边染色质的较多联系应排除是 DNA、RNA 的变化的影响。由于真核生物 DNA 复制是一个复杂的网络过程，在 DNA 分子进行复制时有多种与复制事件有关的酶及其复合 物与 DNA 分子结合，因此这种表现应与复制事件有关的酶的结合有关。关于核仁中 rRNA 转录位点的争议，目前仍然存在，但比较一致的看法是转录发生于 FC 与 DFC 的交界和 DFC 中，然后在 DFC 中进一步加工，DFC 是 rRNA 的贮存和加工位点 5.6.20
15、。最近有较多文献报道证明转录发生于 DFC21.22.13.23.24 ，但仍有人坚持转录发生于 FC25.14.26。陶伟（2003）以蒜为材料，提出 FC 的 DNA 处于集缩状态并且不含有 rDNA， 为 rDNA 提供锚定位点，rDNA 存在于 DFC 中15。通过柠檬酸铽 ssRNA 特异性染色，我们 研究了核仁内 ssRNA 的分布。由于只发现 ssRNA 存在于 DFC 及 GC 区，而在 FC 中未见， 因此我们认为 rRNA 转录的起始位点应位于 DFC 中。在 NAMA-Ur DNA 特异性染色结果中 我们观察到，在 FC 和 DFC 中都存在 DNA，DFC 中的 DNA
16、 呈弥散状态，FC 中的相对较集 缩，这种分布与 Biggiogera 等在动物细胞中以锇铵染色得到的结果一致21。活跃转录的 rDNA，没有组蛋白结合，应处于解集缩状态。DFC 中的 DNA 正是处于这种状态，因此与 柠檬酸铽 ssRNA 特异性染色共同揭示了 DFC 是 rRNA 的转录区域。由于 FC 中的 DNA 是 集缩的，并且在 FC 中没有发现 ssRNA 分布，在洋葱细胞中可以排除转录发生于 FC 的观点。5.结论1 在洋葱细胞中，核仁在 S 期及 G2 的过渡时期核仁表面出现的毛状突起现象可能是真核 生物 DNA 复制期在常规电镜下的一个明显特征。2 通过对核仁内 ssRNA
17、 分布研究可以得出结论，新合成的 rRNA 存于 DFC 中，在 FC 中 未见。洋葱 rRNA 的转录位点应定位在 DFC 中。参考文献1 Gerbi S A. The nucleolus: then and now. Chromosoma, 1997, 105:3853872 Pederson T. The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res, 1998, 26: 387138763 Olson M O, Dundr M, Szebeni A. The nucleolus: an old factory with unexpected
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30、 ShuiJiao MingdaInstitute of Genetics and Cytology, Northeast Normal University, Changchun 130024AbstractIn this paper, the ultrastructure in different phase nucleoli of Allium cepa were observed with the conventional electron microscopy. We found the nucleolus rim showed hairy and thus more linking
31、 of the nucleolus rim to the peripheral chromatins in S phase. By using the NAMA-Ur DNA specific staining technique and terbium cirate single-stranded RNA (ssRNA) special staining, we investigated the morphological changes of the nucleolus. The results showed this kind of phenomenon was the obvious
32、characteristics of nucleolar structure during DNA replication. Further observations demonstrated that ssRNA mainly distributed in DFCs and their peripheral regions. It therefore can be concluded that the DFC, and not the FC, is the site of rRNA transcription in nucleoli.Key words: nucleolus, DFC, FC, DNA, ssRNA
