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1、第4章 人工种子 与植物脱毒,1.人工种子2.植物脱毒,1 人工种子,农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起保护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，将来发成植株。农业生物技术的发展，通过组织培养技术，可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。,人工种子的概念,人工种子（artifi
2、cial seeds)又称合成种子（synthetic seeds)或体细胞种子（somatic seeds)。是将植物离体培养产生的体细胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜的条件下发芽出苗。人工种子的概念首先是1978年由Murashige在第四届国际植物组织细胞培养大会上提出的。他认为随着组织培养技术的不断发展，可以用少量的外植体同步培养出众多的胚状体，这些胚状体被包埋在某种胶囊内使其具有种子的功能，可以直接用于田间播种。,人工种子的优点,1）培养条件可以人为控制，具有省地省工可直接在田间播种等优点。2）在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等。3）用于
3、制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。4）一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。,以体细胞胚为繁殖体的人工种子,以器官为繁殖体的人工种子,1.1 人工种子的制作,人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的制作、人工种子贮藏等步骤内容。1.1.1 胚状体的诱导与同步化发育 不论是哪一种方式产生的胚状体，在发生和发育过程中一般是不同步的。所以在一个材料中同时可以见到各个不同发育时期的胚状体。因此，控制胚状体同步发育是人工种子制备的关键环节之一。,1）胚状体的诱导：胚状体可从悬浮培养
4、的单细胞得到，也可通过试管培养的愈伤组织、花粉或胚囊获得。胚状体一般在培养物的表面产生，其形状与合子胚类似，但胚状体却是无性繁殖的产物。实际操作中，一般在试管中诱导出愈伤组织，并在含生长素的培养液中悬浮培养，然后置于含生长素的发酵罐中，使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中诱导出大量胚状体。2）胚状体同步化处理或分选：胚状体的同步化是指促使所有培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期。只有同步化了细胞才可能成批地产出成熟胚胎。常用的方法有：（1）化学方法：饥饿法将培养基中的一些重要成分反复去除和添加；阻断法在培养初期加如DNA合成抑制剂，如5-氨基脲嘧啶，阻断细胞分裂的G1期。（
5、2）物理方法：低温处理法、过滤筛选法、渗透压分离法、密度梯度离心法(体胚不同的发育阶段密度有差异)等到胚状体胎成熟以后，就可以进行人工种子的包埋了。其中过滤筛选法较实用、快速。,1.1.2 人工种皮制备,分内种皮和外种皮对人工种皮的要求：具有保护胚的功能，并且无毒性、通气好、抗污染、抗压性好、不粘连、适于贮藏和运输。内种皮常用材料：聚氧乙烯、海藻酸钠、明胶、琼脂等。,外种皮常用材料：Elvax 4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，1987，美国)涂膜，价高，操作复杂，效果不佳。Tullanox和Cab-0-sil(二氧化硅化合物），以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在材料中
6、滚动即可。硅酮种衣，能抗真菌，渗入水蒸汽和氧气，处于试验之中。,1.1.3 人工胚乳配制,成分：无机盐混合物、碳水化合物（糖和淀粉）、蛋白质、植物生长调节剂。糖分存在容易导致微生物感染而腐烂，所以人工胚乳中也要加入防腐剂、抗菌素、有益菌类等。选用无毒、透气和吸水性强的木薯淀粉与1.5%海藻酸钠(1/2MS培养基配制)混合制作的胚乳可改善单一海藻酸钠人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率，人工胚乳中加入（赤霉素）GA3有利于人工种子的发芽，加入CaCl2 有利于向培养物供氧，提高人工种子发芽率和耐贮藏性，加扩活性炭可改善营养固定和缓释，提高人工种子在土壤中的成苗率。,1.1.4 包埋,水凝胶法 是最常
7、用的一种方法。即用海藻酸钠等水溶性凝胶经与钙离子进行离子交换后凝固，用于包埋单个胚状体。种子硬度由凝胶浓度与络合物离子交换时间决定。CaCl2浓度：2.0%-2.5%离子交换时间：20min-30min无菌水漂洗20min,1.2 贮藏,1.2.1 贮藏条件：47低温、相对湿度小于67%1.2.2 贮藏中存在的问题：种胚质量不高、后期停止生长、胚腐烂、种子失水干缩等。1.2.3 解决措施：胚乳中添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、低温贮藏，种皮外包裹滑石粉、液体石蜡等成分。,存在问题,许多重要的植物目前还不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体细胞胚或不定芽。包埋剂的选择及制作工艺
8、方面尚需改进，以提高体胚到正常植株的转化率，并达到加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。如何进行大量制种和大田播种，实现机械化操作等方面配套技术尚需进一步研究。,小结,人工种子是在实验室人工控制条件下生产的繁殖体。人工种子繁殖体包括体细胞胚、微型器官和微芽，根据植物种类不同可适当选择。人工种子应用的基本条件是繁殖体的工厂化生产和配套技术的成熟。无性繁殖植物的人工种子有望最先得以应用。,2.植物脱毒,植物病毒病是作物的重要病害种类之一,目前已发现的植物病毒病害已超过 700种,几乎每种作物上都有一种、几种甚至十几种病毒危害,它们防治困难,危害严重,给农业生产带来了巨大的损失,特别是木本植物和靠营养
9、繁殖的植物,危害性更大一些。在植物病毒病害防治上,植物脱毒技术得到广泛应用。,2.1 脱毒方法 物理法：热处理脱毒 化学法：药剂处理 生物法：茎尖培养脱毒,1）热处理脱毒原理：病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。,2.1.1 物理方法热处理脱毒,依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的
10、温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。,热处理区,B,A,C,2）热处理脱毒方法,(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。（2）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内，一般35-40。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。,热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇叶病毒。热处理对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此
11、，必须与茎尖培养相结合脱毒效果更好。,2.1.2 化学方法脱毒,又称化学疗法。一些化学药品如嘌呤和嘧啶；类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能是病毒失活。近年发现三氮唑核苷（1D呋喃核糖1，2，4三氮唑）用于防治一系列动物DNA和RNA病毒，对植物也有效。将感染了马铃薯Y型病毒（PVY）、黄瓜花叶病（CMV)或烟草花叶病毒（TMV）的叶柄，培养在三氮唑核苷的MS培养基上，子代植株则除去病毒，而对照则无效，说明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。,2.1.3 生物法茎尖脱毒 茎尖微体嫁接 愈伤组织诱导脱毒珠心胚培养法花药培养脱毒,（1）茎尖培养脱毒原理（2）
12、培养基（3）茎尖培养方法（4）影响微茎尖培养的因素外植体大小 培养条件 外植体的生理状态,1）茎尖培养脱毒,（1）茎尖培养脱毒原理 病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm）几乎不含或含病毒很少。,植物的去病毒技术，实质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.5mm带12个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。,1、植物体病毒的移动的2条途径：维管系统和胞间连丝。2、植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争 3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。4、在植物
13、体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。,分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：,（2）培养基 一般以White、MS为基本培养基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培养某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素可能在第2对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在生长素中应避免用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用NAA或IBA；细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培养有用。,（3）茎尖的培养方法 需要一台解剖镜（8-40倍）。剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸
14、的培养皿内进行操作，以防茎尖变干。消毒：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。,离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响,切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎尖大小要合适。,The Apical Meristem,剥取茎尖过程:解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培养基上。将接种的茎尖置于22左右温度下。2000-3000lx 16h/d 光照下培养。由于在低温
15、和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。,茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。,（4）影响微茎尖成活及脱毒的因素首先是母体材料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。外植体大小 在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。,培养条件 在茎尖
16、培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光照强度便增加到4000 lx。外植体的生理状态 茎尖最好要由活跃生长的芽上切取。取芽的时间也很重要，一般选萌动期较好。否则采用适当的处理，打破休眠才能进行。,茎尖与热处理相结合方法,能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。1、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。2、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗。,2）茎尖微体嫁接 木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4-1mm茎尖，在砧木上进行
17、试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。,3）愈伤组织培养脱毒 愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。,愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株。,4）珠心培养法脱毒,柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚 大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去
18、柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。,5）花药培养脱毒,花药培养实际上是单倍体培养，由此获得单倍体植株，再通过染色体加倍获得无病毒植株。,2.2 脱毒植物的鉴定 利用生长点培养无毒苗的成苗率和脱毒率都非常低，有时无毒株只占千分之几。因此，每一茎尖分化产生的植株，在作为母本生产无病毒原种以前，必须进行特定病毒鉴定。由于在培养的植株中许多病毒具有延迟的恢复期，所以在最初18个月中每隔一定时间仍需进行鉴定。只有病毒显示持续阴性反应的无病毒植株，才能进一步扩大繁殖。无病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同时期仍需重复进行鉴定。常用的鉴定法有直接测定法、指
19、示植物法、抗血清鉴定法和电子显微镜检查法等。外观判断法直接检测法 指示植物法 抗血清鉴定法 电子显微镜检查法 酶联免疫鉴定法(ELISA)分子生物学方法,2.2.1 外观判断法：带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。,2.2.2 指示植物检测法：指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。通常不同病毒应选用不同的植物。马铃薯病毒常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、辣椒等。,分为2种 汁液感染法 嫁接检测法,利用嫁接法接种，把待测的植物接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒。,指示植物,接穗,嫁接后的植物,2.2.3 抗血清鉴定法（抗原抗体反应）原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体结合产生血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗体的血清称为抗血清。,
