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1、第2章 难治性溶血性贫血 .标拄渊豫狗妻结骆煞喀先晚汀遣轩露匝馁睹束巫饭零旭胆鸯召邻箔吊面辜峡皖否乒撬淮竿郡锋插齿豢掺牛硅沥锦芦筑驶淖刮挤孔潍惕搜腑比渭荚鳖案铱昂膊查剐漓邦名韩编绢死苍鼓助徘娄晶俏币琐烩谭厉新击狭鹰蛇费蔗泻症晋氯筷残质拧阮稻瀑僳全犊瘤灰恰储豌运屡滋液刻嫩裁聚创橇康犀滞糜喳窖忽葬巡炔温外蓄吟尔郁僚尖柿佬准角逮井玲嚣瞧扦漏集戎窥呈臭嵌毙潍匪袄琼落峦氟迹谢钢惫陨张洁蕴诺屎锻脯碑南唆出苇郸尘疤滦歌炮蚌浴犯婿巷嗅酣苍洽剑瘸篷慷赋羞核侨蒂青甜绸浇古缠厉粘老阻茎鳃避船锹筹账瞩枷砧逊叁逗象挺暴晾褂茶纤投挑欢柞郑峪贫之鳞祥讯垦件磊骨言讼第二章 难治性溶血性贫血溶血性贫血是由于红细胞破坏加速，超过
2、了骨髓造红细胞的代偿能力而出现贫血，是一大类疾病的总称。血循环中正常红细胞的寿命约110120天，衰老的红细胞被不断地破坏与清除，新生的红细胞不断由骨髓生成与释放，维持着动态平衡。溶血性贫血时，红细胞的生存时间有不同程度的缩短，最短只有几天。当各种原因引起红细胞寿命缩短、破坏过多、溶血增多时，但溶血程度并不严重，原来骨髓的造血功能正常，那么骨髓的代偿性造血功能可比平时增加68倍，临床上可以不出现贫血。这种情况叫“代偿性溶血病”。如果骨髓的代偿造血速度比不上溶血的速度，临床上就会出现贫血的表现。溶血性疾病有多种分类法。从病程出发，可分为急性型和慢性型。从遗传学观点，可分为先天性溶血和后天获得性溶
3、血，但先天性者不一定一出生就发病，而后天获得性者却有一出生就出现溶血者（表1）。从发病机制分类，可分为红细胞自身缺陷和红细胞外因素所致溶血。从实验角度出发，可分为免疫性溶血和非免疫性溶血。各种分类法各有千秋，它可从不同的角度帮助人们认识溶血和诊断溶血。表1溶血性贫血分类法先天性后天性红细胞膜先天异常所致溶血性贫血免疫性溶血性贫血遗传性球形红细胞增多症温抗体型自身免疫性溶血性贫血遗传性椭圆形红细胞增多症冷抗体型自身免疫性溶血性贫血口形红细胞增多症兼有温、冷双抗体的自身免疫性溶血性贫血棘状红细胞增多症药物诱发的免疫性溶血性贫血遗传性干瘪红细胞增多症新生儿同种免疫性溶血性贫血红细胞酶缺乏所致溶血性贫
4、血阵发性睡眠性血红蛋白尿症葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症红细胞机械性损伤所致的溶血性贫血丙酮酸激酶缺乏症行军性血红蛋白尿症其他红细胞酶缺乏症创伤性心源性溶血性贫血珠蛋白合成异常所致溶血性贫血微血管病性溶血性贫血异常血红蛋白化学物质、物理因素及微生物因素所致的溶血性贫血血红蛋白S化学物质所致的溶血性贫血血红蛋白C、D、E物理因素所致的溶血性贫血不稳定血红蛋白生物毒素所致的溶血性贫血血红蛋白M微生物所致的溶血性贫血氧亲和力改变的血红蛋白珠蛋白生成障碍性贫血类珠蛋白生成障碍性贫血由于发病机制的不同，溶血性贫血的治疗也各不相同。对于先天性的溶血性贫血，需要做好的是产前诊断，出生后仅能根据病情的发展进行对
5、症支持治疗。而后天性的溶血性贫血，能去除诱因的则需去除诱因，能使用药物治疗的则使用药物治疗，一般都能取得良好的效果。而目前存在治疗困难的溶血性贫血临床上并不少见，本文重点介绍免疫性溶血性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿这两类溶血性贫血。一、免疫性溶血性贫血定义由抗体参与的溶血反应所致的贫血，称为免疫性溶血性贫血。这种特异性免疫反应，即称为第型过敏反应，是由于红细胞本身与外来抗原（包括如药物等半抗原）结合，与相应的抗体（大多是IgG或IgM）作用后，在有或无补体的参与下，引起红细胞的聚集和溶解而发生溶血；吸附有抗体的红细胞也可通过脾或肝内巨噬细胞的吞噬作用而破坏。分类自身免疫性溶血性贫血的自身抗体根
6、据其作用于红细胞时所需温度可分为温抗体和冷抗体两大类。温抗体一般在37时作用最活跃，可分为不完全温抗体及温抗体自身溶血素。前者约占所有自身抗体的大多数，主要是IgG，其次为非凝集性IgM，而IgA很罕见。IgG性不完全温抗体又可分为多种亚型。主要为IgG1及IgG3，IgG2及IgG4均少见。冷性抗体在20以下作用最活跃，凝集素性IgM较多见于冷凝集素综合症，可直接在血循环中发生凝集反应，所以是完全抗体。在阵发性冷性血红蛋白尿所见的为一种特殊冷抗体（7SIgG），在20时吸附在红细胞上，当温度升高后即与细胞分离，称为冷热抗体（即Donath Landsteiner antibody，D-L抗体
7、）。难治原因分析1.发病机制不明抗红细胞自身抗体的产生机制尚未阐明，可能因素有以下诸方面：病毒 感染可激活多克隆B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性等均可能导致自身抗体。据报道1，B19微小病毒感染可引起免疫性溶血性贫血。淋巴组织感染或肿瘤、胸腺疾患以及免疫缺陷等因素，使机体失去免疫监视功能，无法识别自身细胞，有利于自身抗体产生。T细胞平衡失调学说，实验检查发现自身免疫性溶血患者有抑制T细胞减少和功能障碍，也有辅助性T细胞有特定亚群活化，使相应B细胞反应过剩而发生自身免疫性溶血性贫血。细胞的免疫系统通过多种机制进行抗原识别。在识别免疫球蛋白表面颗粒和复合物的相关受体中，最重要的家族是F
8、c受体。Fc受体通过Ig的Fc片段进行识别，并根据Fc片段分成不同的亚组，Fc受体根据结合的Ig来命名。主要的Fc受体有结合IgG的FcR，结合IgA的FcR，结合IgE的FcR2。Fc受体担负的功能有内吞作用、吞噬作用、颗粒释放、反应介质释放和细胞的活化/细胞的毒性作用。Fc受体根据它们发送信号的能力和结构分成两组。首要和最常见的Fc受体是多链杂合物，由一条链和一条或多条传导信号的链组成。其次的Fc受体是一条单链的跨膜受体，包含细胞浆区域内信号产生的基序和不需要信号传导的亚单位。IgG的同种异型受体有结构上的变化，并根据与配体亲和力和信号传导能力的不同而进行区分。Fc受体可以分成三个类型：F
9、cR，FcR和FcR。IgG的同形异构体决定结合的Fc受体结合的类型和信号传导的本性。疾病的发生都是基于Fc受体的相互作用而产生炎症、吞噬和内吞作用。AIHA是由Fc受体介导的自身免疫性疾病，即自身抗体对红细胞抗原的反应。AIHA在很大程度上是因为自身抗体对红细胞3带的反应，在红细胞膜上发现有关红细胞衰老的离子转运蛋白。在肝脾单核巨噬系统中巨噬细胞上的Fc受体也参与溶贫的发生。实验研究发现证实了AIHA疾病中Fc受体的作用 3。实验诱导产生的AIHA发现老鼠明显缺乏链,而且使用单克隆抗体2.4G2，能够结合老鼠的FcR和Fc R，对诱导产生的AIHA可以迅速恢复。与之相反使用GM-CSF，能够
10、潜在地上调FcR的功能，进而加速AIHA的发展4。这些研究发现，改变刺激物的平衡来抑制Fc受体可以对疾病的进程和易感性产生作用。因此，病毒的感染可以刺激和增加AIHA的发生。然而，病毒引起发病的机制尚未完全阐明。可能的解释是：病毒感染后刺激IFN的产生增加而导致上调FcR。同样，病毒的感染，由于转录的增加或其他机制，可改变Fc受体类型的表达。2.治疗药物的作用机制不明1)激素作为治疗AIHA的常用药物，然而，其作用机制却不明。激素的作用机制可能有四：作用于淋巴细胞及浆细胞，抑制抗体的产生。激素治疗有效病例，无论直接或间接抗球蛋白试验效价都减低。表示吸附在红细胞上或游离在血浆中的抗体都相形减少。
11、但治疗后抗体量与临床的缓解程度不相称，临床改善以较抗体减少更为迅速而明显，因而考虑到抗体生成减少可能仅是激素作用机制之一；Roose曾观察到激素治疗后48h，红细胞上吸附抗体量减少而血清中游离抗体量增多，激素可能改变抗体对红细胞膜上抗原亲和力；Petz则认为激素可减少巨噬细胞上的IgG及C3受体或抑制这类受体与红细胞的结合能力。一般在用药后四五天，单核-巨噬细胞系统清除致敏红细胞能力即见减退，尤以抗体致敏者。泼尼松和地塞米松证实能够下调Fc受体的表达，因此潜在地降低IgG包裹微粒的吞噬作用。2) IVIg被认为是使用激素治疗无效或出现难治后，临床上常用的药物，但其作用机制也是不明确的。目前认为
12、，IVIg治疗自身免疫性疾病的机制有如下几点:(1) 封闭单核巨噬细胞的Fc 受体，非特异性阻断Fc 受体介导的巨噬细胞的功能，使自身抗体介导的组织细胞的破坏减少；在局部的高浓度的IgG下，IVIg能够结合低亲和力的Fc受体，阻断与IgG包裹细胞的结合，或绝对性竞争结合高亲和力的免疫复合物，避免红细胞破坏。在IVIg制剂中存在IgG二聚体的可能性，能够进一步加强阻断作用。5(2) 另一个可能即抑制FcRb，从而抑制因Fc受体活化而介导的吞噬作用。6在静脉注射IVIg的老鼠模型中，能够增加脾细胞中非B细胞表达FcRb的比率。相对于活化受体的表达来说，增加这个受体的表达，能够降低IgG包裹红细胞的
13、吞噬作用。在IVIg介导下，增加Fc受体表达的作用机制尚不清楚。(3) 下调B淋巴细胞的激活，阻止其分化为分泌抗体的浆细胞，减少自身抗体的产生；(4) 通过Fas 和一系列半胱氨酸蛋白酶的激活等途径诱导淋巴细胞和单核细胞的凋亡；(5) 调节一些来源于淋巴细胞和单核细胞的细胞因子的合成和释放；(6) 竞争或抑制抗体或循环免疫复合物与自身抗原的结合；(7) 加速循环免疫复合物的灭活； (8) 清除持续存在的病毒感染等。临床表现本症临床表现多样化，轻重不一。一般起病较慢，数月后才发现有贫血，伴有头昏及全身虚弱。急性发病多见于小儿，偶也见于成年患者；起病急骤，有寒战、高热，患者诉腰背痛、呕吐和腹泻。贫
14、血明显时有神经系统表现，例如头痛、烦躁以至昏迷。 苍白及黄疸约见于1/3患者，半数以上有脾肿大，一般轻至中度肿大，中等硬度，不痛。原发性病例，1/3有中度肝大，中等硬度而不痛；明显肿大者极少见。温抗体自身免疫性溶血性贫血患者中有26%既无肝、脾肿大，也无淋巴结肿大。 实验室检查贫血程度不一，有时很严重，血红蛋白可少于70g/L，甚至50g/L。典型血象为正常细胞、正常色素性贫血。血片上可见多量球形细胞，偶见红细胞被吞噬现象。网织红细胞多增高，极个别可高至50%。溶血危象时网织红细胞明显减少，可能自身抗体同时作用于幼红细胞所致。网织红细胞减少者预后多不佳。半数以上患者白细胞数正常。急性溶血时，白
15、细胞增多(1525)109/L，甚至有类白血病反应。如同时伴有免疫性白细胞破坏，白细胞可少于2.0109/L。血小板数多在正常范围，但也有以血小板增多为首见表现者。有些患者病程中发生血小板减少，1954年Evans及Duan称为Evans综合征。骨髓多增生活跃，以幼红细胞增生为主而全血细胞增生者较少。诊断对获得性溶血患者，直接抗球蛋白试验阳性，为IgG和(或)C3型，4个月内无输血或特殊药物史，结合临床表现，可考虑为温抗体型自身免疫性溶血性贫血。对直接抗球蛋白试验阴性的自身免疫性溶血性贫血诊断比较困难。现今较直接抗球蛋白试验更敏感的试验方法，例如补体结合抗体消耗试验等需要特殊设备和技术，尚未能
16、在一般临床医院普及。有条件时可进行酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)处理红细胞的凝集试验以检测血清中游离的自身抗体。有时通过激素治疗和排除其他溶血性贫血而得以确诊。确定自身免疫性溶血贫血的患者必须进一步探索原发性疾病的存在与否。治疗1. 病因治疗和治疗反应 积极寻找病因，治疗原发病最为重要。自身免疫性溶血性贫血治疗首选肾上腺皮质激素，能使80%的患者获得缓解，但长期缓解率只有13%16%，大部分在减药过程中或停药后复发。国内文献报道，Coombs试验阴性型复发率为30.8%(13例中4例复发)， 温抗体型复发率为54.0%(24例中13例复发)，冷温双抗体及冷抗体型复发率为86.7%(15例中13例
17、复发)，合并冷抗体患者复发率明显高于其他两型(P0.05)；抗体效价和100的患者复发率为92.9%(14例中13例复发)，抗体效价和100者复发率为59.1%(22例中13例复发)，随着抗体效价升高，复发率明显增高(P0.05)，反复感染者易复发。 2肾上腺皮质激素(简称激素) 为治疗温性抗体自身免疫性溶血贫血的首选药物。开始剂量要充足，以泼尼松为例，每日总量约需1-1.5mg/kg体重。如治疗有效，临床症状先好转，约1星期后红细胞迅速上升。治疗3星期无效，须及时更换其他疗法。一旦红细胞数恢复正常后，应缓慢减少剂量；泼尼松每星期减少日服量10-15mg；待每天量达30mg后，以后每星期或每2
18、星期减少日服量5mg；至每天量仅有15mg，每2星期减少日服量2.5mg。小剂量激素维持至少3个月或更长时间。每天至少需口服泼尼松15mg才能维持血象缓解者，应改换其他疗法。 3达那唑(danazol) 系人工合成的17-乙炔睾酮衍生物，性作用较弱。1990年Ahm报告28例自身免疫性溶血贫血用danazol治疗，原发性13例和继发性15例，有效率分别为77%和60%。Ahn建议对严重自身免疫性溶血贫血，激素与达那唑合用，两者有协同作用；贫血纠正后激素可先减量，后停用，单用达那唑维持，一般疗程不少于1年，否则易复发。4环孢菌素A 它含有11个氨基酸的环状多肽，多用于器官移植，以抑制排斥反应。1
19、986年Pogglitscb首先报告一例自身免疫性溶血贫血用泼尼松无效，经血浆置换术后用环孢菌素A 3mg/kg，以后取得缓解。Hershko(1990)报告3例自身免疫性溶血贫血(其中一例为Evans综合征)，激素未能控制溶血，加用环孢菌素A 4-6mg/kg/d，2星期后溶血逐渐缓解。环孢菌素A能抑制辅助T细胞生成，从而阻断了淋巴因子产生。环孢菌素A对B细胞也有作用，抑制抗体产生。临床资料表明，环孢菌素A联合激素和达那唑克提高并巩固疗效。5大剂量静脉注射丙种球蛋白 对自身免疫性溶血贫血的疗效不及特发性血小板减少性紫癜，甚至偶尔可加重溶血。Newland(1988)报告用静脉注射丙种球蛋白治
20、疗34例自身免疫性溶血贫血，仅1/3病例取得暂时缓解。标准剂量的IVIg联合糖皮质激素治疗AIHA比传统的方案更能迅速控制病情，同时在短期内可增强和巩固糖皮质激素的疗效，对糖皮质激素具有显著的协同作用。因此糖皮质激素、雄激素联合IVIg可作为AIHA的一种首选的治疗方案。6脾切除 脾脏是抗体的生成器官，又是致敏红细胞的主要破坏场所。如果肾上腺皮质激素无效，或需较大剂量才能维持缓解者，或因激素副作用明显，均可考虑脾切除。切脾后致敏红细胞的存活期延长。Roose观察到切脾后，保持同等程度红细胞的破坏率所需抗体量约10倍于切脾前所需量。7抗肿瘤化疗 引起溶血的相关抗体有温抗体或冷抗体。在大多数的病人
21、中，使用糖皮质激素治疗有效，但容易复发。那些对糖皮质激素没有反应的病人，脾切除可作为二线治疗。其后补救治疗包括静脉输注丙球、达那唑，和一系列的免疫抑制剂，如小剂量的环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢霉素和长春新碱。冷凝集素自身免疫性溶血性贫血对这些治疗方法疗效欠佳。应用抗肿瘤化疗的免疫抑制剂指征有三：激素或切脾都不能导致缓解者；脾切除有禁忌证者；每天泼尼松量需10mg以上者。硫唑嘌呤、环磷酰胺、甲氨蝶呤及甲基苄肼等均为常用免疫抑制剂；硫唑嘌呤为2-2.5 mg/kg/d，环磷酰胺为1.5-2mg/kg/d。Moyo VM等7学者使用大剂量的环磷酰胺进行治疗。9例病人中5例男性和4例女性，中位年龄为52岁
22、，7例为温抗体型，1例为兼有温、冷抗体，1例为单纯的冷抗体型。病人已平均接受了3次传统治疗方案（范围从1到7次），3例病人已接受了脾切除，平均血红蛋白为67g/L（范围从50到100 g/L），8例病人依赖红细胞输注。方法为使用大剂量的环磷酰胺50mg/kg/天，共使用4天，常见的副作用为恶心、呕吐、短暂的脱发和中性粒细胞减少性发热。住院的中位时间为21天。所有病人都能不依赖红细胞输注，其中6例病人达到CR，3例病人达到PR。治疗之前，病人需要的泼尼松量平均为40mg/天，治疗后7例不需要再使用激素，2例仅需要最低的维持量。在接下来的平均15个月中，无一例病人复发。Ito S等同样报道8使用环
23、磷酰胺和大剂量丙球治疗B19病毒感染并发的难治性溶血性贫血，取得缓解。8 CD20单克隆抗体 CD20抗原存在于B细胞各前体细胞及成熟B细胞，而浆细胞不表达CD20。Rituximab是一种基因工程人/鼠嵌合抗CD20单克隆抗体。Rituximab通常用于治疗B细胞型的非霍奇金淋巴瘤，而目前日益广泛的应用于自身免疫紊乱性疾病9，如特发性血小板减少性紫癜、AIHA、系统性红斑狼疮和血管炎。一例10温抗体AIHA合并原发性抗磷脂综合症（APS）。该病人对大剂量的糖皮质激素耐药。考虑到血栓形成和/或出血性牙周炎的并发症的风险性，不考虑进行脾切除。病人在接受了四周的Rituximab治疗后，有了迅速和
24、稳定的反应，即能够渐进性地减少泼尼松剂量至5mg/天。而且，IgM抗心磷脂抗体的滴度从大于600MPL减少到小于100MPL。对于使用Rituximab的13个AIHA病人进行进一步的回顾性调查发现，有良好的耐受性和高的反应率。对于难治性的AIHA病人和考虑到因进行脾切除带来的高并发症的风险，用Rituximab治疗可以比脾切除优先考虑。13例成年、有温抗体而没有淋巴增殖性疾病的病人使用Rituximab治疗。9例病人有效，能够逐步减少糖皮质激素的用量至最小维持剂量或完全撤退。而2个病人对糖皮质激素耐药，意味着不能减少糖皮质激素的剂量。另外2例病人死于与AIHA不相关的并发症。Rituxima
25、b在冷抗体的病例中治疗效相当好。Monica Morselli等11对2例兼有温、冷抗体的病人，使用Rituximab后取得了缓解。血红蛋白从64g/L升到135 g/L。Ramanathan S等12使用Rituximab治疗两例难治性病人，治疗后9个月和15月仍取得缓解。另有Mantadakis E13，Cohen Y14等相继报道，使用Rituximab治疗难治疗或复发的溶血性贫血，效果也相当不错。9其他疗法 抗淋巴细胞球蛋白治疗自身免疫性溶血性贫血尚在试验阶段。Pirof-sky报道1例继发自身免疫性溶血性贫血的系统性红斑狼疮和另一例霍奇金病，都获得较好效果。Maud在1970年报道1
26、0例也取得较好效果。Kunitomi A15等使用单克隆的IL-6抗体治疗，每两周使用8mg/kg，四个月恢复正常，两年内取得长期缓解。 10输血 自身免疫性溶血性贫血患者的自身抗体有时对输入的红细胞也有致敏作用，因而输入细胞的存活期明显缩短。当本病非常严重时，输入红细胞甚至发生显著溶血。有些自身免疫性溶血性贫血的自身抗体显示明显的“相对特异性”，它对具有Rh抗原的红细胞较其他有更强烈的反应，因而仅能输入缺乏这类抗原的细胞，以保持输入细胞的正常生命期。11. 血浆置换疗法 仅是本病一个暂时治疗措施，无根治作用，并需一定设备，大量血浆和白蛋白，价格昂贵，尚难以推广，仅试用于严重病例的抢救措施。二
27、、阵发性睡眠性血红蛋白尿症定义阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种获得性造血干细胞克隆缺陷性疾病，其血细胞（红细胞、粒细胞及血小板）膜对补体异常敏感而被破坏，导致持续性血管内溶血，常有阵发性、睡眠后血红蛋白尿发作，全血细胞减少。患者的血液中同时存在正常的与异常的两类细胞。 难治原因分析（一） 临床变化多样，症状不典型。血红蛋白尿的发作，各病例之间不同。尿发作有时只是颜色稍深，呈浓茶色，有的呈酱油色、红葡萄酒色。大多在起病后12年才发现；也有的长达27年才发生，约有30%病例始终无肉眼血红蛋白尿；血红蛋白尿发作的轻重各不相同，在同一病例不同时期尿发作轻重亦不一致，有的持续发作，有的1个月发作
28、14次，有的几个月发作1次，每次发作12d；大多病例只在晨起时尿呈茶红或浓茶色，有的呈酱油色，白天尿色稍淡，发作重时尿色终日呈酱油色；有的病例尿色正常；只在检查尿潜血时才出现阳性。（二） 病因及发病机制不明，治疗上方法多样。 阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种良性克隆性造血干细胞疾病。异常克隆不具有自主无限扩增的特性，且部分病例可以自愈。其病理基础是位于染色体Xp22.1上的PIG-A基因发生了突变，导致糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成减少或缺失，锚异常进而导致锚连蛋白的缺失。其中，抑制补体活化的调节蛋白，如CD55、CD59的缺失导致PNH患者的血细胞易被补体破坏，从而引起溶血等临床症状。目前的研
29、究表明，除了PIG-A基因突变以外，PNH还存在另外一种致病因素，两因素协同作用才导致PNH发病，这也被称为PNH的双因素发病学说。1近年来，很多学者认为PNH发病的另一种因素可能为T淋巴细胞免疫异常：正常造血克隆被异常的T淋巴细胞杀伤，而PNH克隆可以逃脱这种杀伤作用，从而获得生存优势。1造血干细胞克隆性疾病 Oni等在一例尼日利亚妇女同时镶嵌两种类型G6PD(A及B型)的PNH患者发现，PNH红细胞缺陷只限于一种类型的红细胞，而另一类型红细胞完全正常，提示本病红细胞异常来源于单克隆。Hartmann等(1977年)通过C6PD镶嵌，乙酰胆碱酯酶与血红蛋白双染色也证实本病为克隆起源。从本病患
30、者骨髓祖细胞进行体外培养，如BFU-E，CFU-E，CFU-GM等也证明有两种对补体敏感性不同的集落，这也支持本病是由克隆起源。有人发现红系祖细胞的衰变加速因子呈阳性，而在分化成熟过程中变阴性；在同一集落中可发现有衰变加速因子阳性和阴性两种细胞群。曹燕然等14用半固体培养基体外培养17例PNH患者和12例正常人骨髓单个核细胞(BMMNC)，观察加与不加G-CSF两组粒-单核细胞集落(CFU-GM)和集簇(cFU-GM)形成情况。PNH患者骨髓GPI+CD34+和GPI-CD34+细胞表达粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR、CD114)和干细胞生长因子受体(C-KIT、CD117)的差异。并用
31、流式细胞术检测20例初发PNH患者和12例正常对照BMMNC和CD34+细胞表面GPI锚定蛋白CD59以及CD114和CD117的表达。结果发现PNH患者BMMNC在体外半固体培养基中的生长能力明显弱于正常对照，G-CSF能明显增加正常人BMMNC的CFU-GM和cFU-GM，而PNH患者BMMNC对G-CSF的反应较差。PNH患者骨髓CD34+CD59-细胞表面G-CSFR和C-KIT表达明显比CD34+CD59+细胞减低。这可能是PNH患者骨髓异常克隆体内外对G-CSF反应差的主要机制。肖娟等15用免疫磁珠吸附法富集纯化CD34+细胞，再用流式细胞术分选出PNH患者的CD34+CD59+细
32、胞、CD34+CD59-细胞及正常对照CD34+细胞。分别进行体外扩增液体培养2周，并对扩增前、后的细胞进行半固体培养。发现正常对照的CD34+细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于PNH患者的CD34+CD59+细胞。PNH患者CD34+CD59+细胞及CD34+CD59-细胞体外半固体培养，以及在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo及SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo+Epo组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等二者均无明显差异，说明CD34+CD59-细胞在造血能力上并无内在的优势。 GM-CSF或许是使PNH克隆呈造血优势的原因之一。董红燕等16对阵发性睡眠性血红蛋
33、白尿症(PNH)患者骨髓CD34+CD59+细胞进行体外扩增的方法，并对其与正常人CD34+细胞的生存、增殖及扩增性能进行比较，为PNH患者实现自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)提供重要的实验基础。方法应用免疫磁珠富集纯化CD34+细胞，然后用流式细胞术分选出PNH患者的CD34+CD59+细胞及正常人CD34+细胞。对两种细胞在不同造血生长因子组合下，进行体外扩增液体培养2周。并对扩增前及扩增不同阶段的细胞进行体外半固体培养。发现(1)PNH患者CD34+CD59+细胞在体外能得到有效的扩增，临床上应用具有一定的可行性，能满足大多数PNH患者ABMT或APBSCT
34、的需要。(2)PNH患者CD34+CD59+细胞与正常人CD34+细胞存在部分相同或相似的特性，但是正常人CD34+细胞在生存、增殖、形成CFU的能力及扩增能力上均明显强于PNH患者的CD34+CD59+细胞，说明PNH患者的CD34+CD59+细胞并非完全正常的细胞。2.近年来研究证明PNH患者血细胞缺乏GPI连接蛋白是由于GPI生成障碍，所以这些连接蛋白不能连接在膜上。1993年日本Takeda等报告本病患者GPI锚的缺乏是由于位于X染色体短臂Xp22.1上的PIG-A基因发生突变所致。以后英美等国学者也相继证实有PIG-A基因突变，但各国PNH患者基因突变的类型并不相同。我国北京协和医院
35、(1997年)也发现4例的PNH患者PIG-A基因突变与日本人相近，而与英美的有一定差异。由于X染色体上PIG-A基因(Xp22.1)突变，导致PNH血细胞糖化肌醇磷脂(GPI)锚蛋白合成障碍。基因突变具有异质性。据报道已发现有100多种基因突变，可累及多个编码区和剪接点，一种异常细胞可有2种突变。同一患者可有2种异常细胞，但只有1种突变。因此同一PNH 患者可有1个以上异常克隆。基因突变造成PNH血细胞GPI锚蛋白合成障碍，GPI锚蛋白合成障碍发生在GPI合成的第一步，即N-乙酰葡萄糖胺不能连接到磷脂肌醇(PI)上，从而引起PNH血细胞GPI锚蛋白缺失，导致PNH血细胞GPI锚连接蛋白的缺失
36、。GPI锚连接蛋白包括一些补体调节蛋白、酶及受体等。常见的有衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)、淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)、中性粒细胞型Fc受体(FcR 11b或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(U-PAR )等。PNH血细胞并非真正缺失这些GPI锚连接蛋白，而是由于锚蛋白的缺失导致GPI锚连接蛋白不能连接上去，从而造成细胞功能障碍。这些GPI锚连接蛋白中以补体调节蛋白CD55和
37、CD59最为重要，血细胞表面的CD55可与C3b或C4b结合。以防止补体继续激活和放大，CD59可防止C9的聚合及膜攻击复合物C5b-9的形成。其中CD59比CD55更为重要。由于PNH血细胞CD55和CD59缺失，最终导致异常细胞对补体敏感而破溶。国内多人通过多种监测方法，研究补体调节蛋白CD55和CD59。国内吴家明17、戴海明18、曹文俊19等多人，通过标记CD55和CD59单克隆抗体，应用流式细胞术检测正常人和阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者、再生障碍性贫血等多种血液系统疾病，发现正常人CD55-、CD59-红细胞5%，而PNH患者则在95%以上，因此CD55、CD59对于PNH的诊断和鉴
38、别诊断，特别是对症状不典型的PNH以及AA-PNH综合征的诊断具有重要意义。单独的PIG-A基因突变不是发病的唯一原因，检出PNH异常克隆和PIG-A基因突变可见于许多血液病，甚至见于正常献血员。PNH克隆只有在骨髓受到损伤、正常造血细胞受到抑制时才得以扩增，从而发病。PNH患者骨髓具有正常及异常两群造血细胞(即CD59+及CD59-两群细胞)同时存在，两群细胞体外生长能力均较正常对照低，但PNH患者的异常造血细胞比其自身正常造血细胞有一定增殖优势，这是因为PNH异常细胞具抗凋亡能力，具GPI锚连接蛋白的正常细胞易被T细胞识别而杀伤。缺乏GPI锚连接蛋白的造血细胞则可逃逸。PIG-A基因突变类
39、型也有所不同。欧美以碱基缺失为主，尤为大片段缺失，日本以碱基取代为主。PNH和再障关系相当密切，可相互转化且并存。15%再障可能转变成PNH，20%30%PNH可伴骨髓再生障碍，抗胸腺球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)治疗再障后1O%31%病例可转为PNH。测定血细胞表面GPI锚连接蛋白，5O%再障患者外周血或骨髓细胞可检出PNH克隆。据我国统计，再障-PNH综合征约占16.5%。总的说来，再障转成PNH为多，PNH转为再障者少。如先为再障，后发生PNH者，其生存率要高于先发生PNH而后发生再障者。直接检测GPI锚连接蛋白可提高PNH诊断率，传统以补体溶血试验诊断PNH。酸化溶血试验
40、(Ham试验)的阳性率为79%，但特异度高；糖水溶血试验阳性率88%，但易出现假阳性；蛇毒因子溶血试验的阳性率为81%。以流式细胞术检测GPI锚连接蛋白缺失细胞数是诊断PNH最直接、最敏感和最特异的方法。Ham试验可检出1% PNH异常细胞，流式细胞术直接检测GPI锚连接蛋白缺失可检出0.1% PNH异常细胞，采用阴性选择法可以提高敏感度。CD59的敏感度高于CD55。PNH克隆累及造血细胞的次序为粒细胞-单核细胞、红细胞-淋巴细胞。CD59粒细胞最早被检出，具早期诊断价值，且受输血的影响少。3.目前很多研究表明PNH存在T淋巴细胞免疫异常，表现在以下几个方面：3.1 PNH与再生障碍性贫血(
41、再障)关系密切：近年来，文献报道再障患者PNH细胞的检出率为30%左右。2其中以具有PNH表型的中性粒细胞的检出率更高。3、4最近，有人利用一种更灵敏的检测PNH细胞的方法(用带有荧光的GPI锚抗体标记血细胞后，以流式细胞术检测)。在18例再障患者中有12例(67%)可检出PNH细胞。5此外，Maciejewski等发现与再障相似，PNH患者中HLA-DR2也存在高表达，提示PNH患者也存在T淋巴细胞免疫异常。63.2 PNH患者可检测到T淋巴细胞的寡克隆增殖：Karadimi-tris等7采用RT-PCR方法检测了T淋巴细胞受体(TCR)中24个链可变区家族。结果表明，同正常对照相比，PNH
42、存在TCR表达明显增加的家族，表明PNH患者存在T淋巴细胞的寡克隆增殖，提示存在T淋巴细胞功能亢进。3.3 PNH骨髓细胞去除T淋巴细胞后集落形成增加：Mer-chav等8将1例PNH患者的骨髓单个核细胞进行体外培养，去除与不去除T淋巴细胞相比，其BFU-E的产率明显增加(4.5倍)，与正常对照相比，差异有显著性。此结果提供了T淋巴细胞参与PNH发病的较直接证据。但此结果尚有待更多病例的验证。3.4 免疫抑制治疗治疗部分PNH患者有效：Schubert等9报道用环孢菌素A(CsA)联合G-CSF治疗4例低增生PNH，4例患者外周血常规都有不同程度的改善，粒细胞、血小板升高尤为明显。通过检测外周
43、血中CD34+细胞、粒细胞的CD55、CD59表达，发现PNH克隆减少。Paqette等10用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)治疗7例PNH患者，3例治疗有效。目前的研究表明，突变的PIG-A基因作为PNH的致病基因已得到确认，单独PIG-A基因突变不能赋予PNH克隆的生长生存优势，不足以解释PNH发病机制。但导致PNH发病的第二种因素仍有争议。目前虽然多数学者认为PNH可能存在T淋巴细胞免疫异常，有部分间接证据支持T淋巴细胞可能参与了选择性杀伤PNH患者正常克隆，但尚缺乏充足的实验室证据；同时，临床报道免疫抑制剂治疗PNH的例数很少，是否真正有效尚待更多病例验证。因此，T淋巴细胞免疫异常在PNH发
44、病中的作用仍处于假说阶段。临床表现本病患者发病大多缓慢，以贫血症状为首发表现；但也有少数病例因急性溶血，突然发生酱油色尿而被发现。自觉症状中以乏力、头晕、面色苍黄、劳累后心悸、气短等贫血症状为最多见。贫血程度随血红蛋白尿发作频率与骨髓造血功能而不同，有的患者虽有血红蛋白尿发作但骨髓造血功能代偿性增加，仅有轻度症状；有的虽无尿发作，但骨髓造血功能不佳，可有明显症状。 血红蛋白尿发作常有一定诱因如劳累、上呼吸道感染、发热、输血反应，药物治疗如铁剂、维生素C等，以及酸性食物、精神紧张、月经期、手术等。 少数病例可有皮肤出血、牙龈出血、发热等，这与血小板减少有关。有的发生血栓形成。国外患者在严重发作时
45、可有腹痛、背痛或腰痛；特别是腹痛，与腹腔内血管血栓形成有关，血管栓塞在欧美病例多见，国内明显少见。 在体格检查中，多数患者皮肤苍白带黄，巩膜微黄染，有的病例皮肤有色素沉着，皮下出血点及紫斑，心脏可有代偿性扩大，肝肿大者较脾肿大者多，肿大程度均不严重，约有半数病例肝、脾不肿大。 实验室检查 1血象 本病患者大多有不同程度贫血，血红蛋白大多为5070g/L，仅有少数病例需输血维持，多数病例只要血红蛋白尿发作不明显，可不输血，或偶输血即能维持；网织红细胞大多有不同程度增加，频发者网织红细胞绝对值较正常者约高4倍，偶发者约为正常2倍，不发者稍高于正常，三组间有显著差异；也有少数网织红细胞低于正常者。
46、2骨髓象 大部分病例骨髓增生明显活跃或活跃，约有10%病例增生减低或重度减低；红系明显增多，主要为中幼及晚幼红细胞增多；易见核分裂、Howell-Jolly小体，可有两核、三核幼红细胞或巨幼样变；粒细胞系相对减少，个别病例原始及早幼粒细胞稍多，成熟停滞，中幼粒细胞胞核、胞质发育不平衡；巨核细胞正常或减少。约有1/3病例非造血细胞如网状细胞、浆细胞、组织嗜碱性细胞等易见。 3其他化验 1)尿 自酱油色、红葡萄酒色、浓茶色及淡黄色不等，色淡者尿潜血可阴性，但大多数病例含铁血黄素试验阳性；可有尿胆原增高，尿铁排泄增多，在不发时也比正常高89倍，一般每天排泄铁达3.615.9mg。 2)溶血改变 血浆
47、游离血红蛋白增高，触珠蛋白减低，粪胆原排泄增加，间接胆红素增高。3)铁代谢 患者时有血红蛋白尿发作者，持续铁的排泄可引起缺铁，血浆铁减低，总铁结合力高于正常。诊断与鉴别诊断本病有典型溶血性贫血的表现及阵发的、与睡眠有关的血红蛋白尿发作，诊断并不因难。但患者的临床表现差异较大，误诊常由于未考虑本病的诊断。有时误认为血尿而诊断为肾炎，有黄疸、肝大而诊断为黄疸性肝炎，还应与其他溶血性贫血如自身免疫溶血性贫血等鉴别。有血红蛋白尿发作者应与阵发性冷性血红蛋白尿症与行军性血红蛋白尿症鉴别；血红蛋白尿不发作病例，除贫血或偶有出血症状外，可无特殊临床表现，如同时有全血细胞减少，骨髓增生不良，更易与再生障碍性贫
48、血混淆。我们体会：在再生障碍性贫血患者，应将尿含铁血黄素试验、Ham试验(酸溶血试验)、糖水试验等作为常规检查，并在病程过程中应反复检查这些试验。 诊断本病的试验常用热溶血试验、糖水试验作为筛选，此两种试验敏感性高，但特异性差，在遗传性球形红细胞增多症、某些自身免疫溶血性贫血等也可出现阳性。用酸溶血试验及蛇毒因子溶血试验作确诊试验，此两种试验特异性强，但敏感性稍差，有时可以出现假阴性结果，蛇毒因子溶血试验比酸溶血试验敏感，同时检测可互相补充。现强调上述四种试验中有两种以上阳性或一种试验连续检测两次以上阳性，并伴有典型血红蛋白尿，除外其他溶血性贫血者即可诊断此病。治疗 本病除骨髓移植外，目前尚无特效治疗方法，但给以正确处理，减少急性溶血和并发症的发生，如避免过分劳累与精神紧张，避免感染发热，避免滥用药物，避免诱发因素，以免导致血红蛋白尿发作，加重病情。常用的治疗方法有下列几
