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1、Methods for quarantine and identificationBurosfaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) NickleSNT 1132002前言本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C、附录D均为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：沈培垠、徐培方、周弘、刁彩华。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 范围 本标准规范了松材线虫检疫鉴定方法和依据。 本标准适用于口岸植物检疫过程中鉴定松材线虫。2 术语和定 义 下列术语
2、和定义适用于本标准。2.1松材线虫 pine wood nemato，dePWN一种线形动物，隶属于动物界、线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(Tylenchida)、滑刃科(Apelenchoidoidea)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。能引起松树萎蔫病，是针叶树木上最重要的病原生物之一。2.2分散型3龄幼虫 dispersal larva ，3LIII松材线虫为扩散和度过不良生存环境，在寄主组织中出现的一种特定类型的3龄幼虫。2.3持久型4龄幼虫 dauerlarva，4 L松材线虫检疫鉴定方法松材线虫为扩散传播，适应不良环境，在媒介天牛
3、和寄主组织中出现的一种特定类型的4龄幼虫。2.4繁殖型3、4龄幼虫 propagative larva 3 and propagative la，rvLa3，4L4松材线虫正常生长和繁殖期出现的幼虫虫态。2.5雌虫早期 young female龄4 幼虫刚完成蜕皮阶段而出现的早期松材线虫雌虫，具体表现为生殖系统发育尚未完全。3 检疫原理 松材线虫分布在被感染寄主的树体组织中，利用其在水中的活动性和密度大于水的特性，可以将寄主组织破碎后浸泡在水中，使松材线虫从寄主组织中游离到水中，从而分离和获得松材线虫。依据松材线虫成虫头部、食道的形态特征、雌虫的阴门、尾端和雄虫交合刺、交合伞形状等稳定遗传的形
4、态特征以及体长、体长体宽比值等测利用甘油置换松材线虫体内的水，可以使松材线虫标本能保存较长时间，从而方便对标本进一步鉴定。4 仪器及用具4.1 木工锯或电锯木工钻；4.2 样品袋；4.3 贝尔曼漏斗；4.4 浅盘(筛盘、底盘)；4.5 改进型漏斗分离器；4.6 标准套筛(40目、400目、500目)；4.7 显微镜(放大倍率401 00，具目镜测微尺、绘图仪等)；4.8 体视显微镜(放大倍率1080，具透射光源)；4.9 超净工作台；4.10 恒温培养箱；4.11 恒温烘箱；4.12 钟面皿(7 c9 cm；4.13 培养皿(7 c9 cm；4.14 酒精灯；4.15 盖玻片；4.16 载玻片
5、；4.17 线虫挑针；4.18 控温电热平板。5 药品和材料5.1 指甲油5.2 0.硫酸链霉素(配方见附录A中A.6)；5.3 TA倍液(配方见附录A中A.1)；5.4 棉蓝-乳酚油(配方见附录A中A.2)；5.5 福尔马林甘油液(配方见附录A中A.3)；5.6 封片蜡(配方见附录A中A.4)；5.7 PD养基(配方见附录A中A.5)；计值，鉴定松材线虫。5.8 灰葡萄孢菌(Botrytis cinere)a。6 现场检疫6.1 直观检验 对应施检疫物观察材质是否干燥，木质部有否蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。6.2.1 选取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕
6、迹的松木或其加工制品，若无上述特征时可随机抽样。抽样数量为每批总件数的0.5 %5%，最低不得少于三件，不满三件时全部抽取。6.2 抽样和取样6.2.3 取样时注意选取靠近虫道、蛹室的部位，钻取木屑时要注意先把取样部位的树皮剥净。6.2.4 必要时可将样木整件带回实验室检验。7 实验室检验7.1 松材线虫的分离 松材线虫分离方法见附录B。7.2 线虫的镜检在体视显微镜下观察钟面皿中收集的线虫分离液，发现线虫后用挑针挑取或用50 g微量移液器吸取线虫并制成临时水玻片，在显微镜下观察。7.2.1 临时水玻片的制作在载玻片上滴加一小滴水液(约50 L)，将线虫挑至水滴中央，沉底。从水滴正上方加盖玻片
7、，在酒精灯上用1虫恰好被杀死。的s 振幅周期通过10次左右，使线6.2.2 将所抽的样木锯成5 cm左右的木段，或用木工钻多点钻取木屑(不得少于10 g 份)，标号后即送样至实验室检验。7.2.2 每份样品的分离液中线虫含量在20条以下的，全部制成临时水玻片境检；20条以上时，通过解剖镜观察选取各类各虫态线虫制片镜检，每类每 虫态线虫至少镜检三条以上。7.3 松材线虫的培养 分离得到的松材线虫雌、雄成虫数量极少或仅发现幼虫时，须进行培养获得足够的雌、雄成虫，以进一步鉴定。培养方法见附录C。7.4 松材线虫的虫体测计7.4.1 标本制作 在进行虫体测计时，需杀死、固定松材线虫，确保虫体各器官定型
8、，并制作玻片标本，供虫体测计。松材线虫标本的制作方法见附录C。7.4.2 虫体测计分别测量雌、雄成虫虫体的长度、宽度及有关器官的长度，并记录测量的数据，然后按德曼公式(De Man formul计a)算各种比值，用相应的符号 表示。测计方法见附录C。8 形态鉴定特征8.1 松材线虫雄虫(见图1)热力杀死后虫体呈“J”形；头部缢缩；口针细长13m左右，基部稍增厚但不形成基部球；中食道球卵圆形，占体宽三分之二以上，食道腺长叶 状覆盖在肠背面；排泄孔位于食道和肠交接处；半月体在排泄孔后三分之二体宽处。尾部侧面观呈鸡爪状向腹部弯曲，交合刺大，弓状，成对，喙突 显著，交合刺远端有盘状突，端生交合伞卵圆形
9、(背、腹面观)。8.2 松材线虫雌虫(见图1)热力杀死后呈弓形，前部特征和雄虫相似。阴门开口于虫体中后部70左右处，开口处有向后延伸的阴门前唇阴门盖。尾部亚圆锥状，尾端 指状，偶尔有尾尖突，尾尖突位于虫体尾部正中间，长约1m2m(不超过2m)。8.3 松材线虫幼虫 松材线虫幼虫分为繁殖型幼虫和分散型幼虫，其形态特征可作为辅助特征应用。8.3.1 繁殖型幼虫无生殖器官，其他形态特征同成虫。处于生活期，体内脂肪颗粒少，肠内食物多，结构模糊，体色呈暗色。繁殖型3龄幼虫蜕皮成繁殖型4龄幼 虫；繁殖型4龄幼虫蜕皮成为成虫。8.3.2 分散型3龄幼虫 其形态上与相应龄期的繁殖型幼虫相似，但体内脂肪颗粒多，
10、表皮增厚，食道部分因退化，有时表现不清晰。8.3.3 分散型4龄幼虫(又称持久型幼虫)该类型幼虫食道严重退化，口针不易被发现，虫体表皮胶质多。8.4 松材线虫的测计值(见表1和表2)松材线虫的虫体测计值可反映其器官的位置、器官与器官的比例，可作为辅助鉴定特征应用。不同疫区的松材线虫虫体测计值有一定的差异。A雌虫； B雄虫； C雄虫尾部；D雄虫尾部(腹面观)； E交合刺(腹面观)； F雌虫前部； G_雌虫阴门；H-J雌虫常见的三种尾型(H标准尾型、I-J略有尾尖突)。图1 松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & bu，hr1e9r34) Nickl，
11、e 1970.仿Nickle等，1981线虫疫区LmStmabcSpmN|条美国1021(8111188)15.1(14.916.2)40.8(3250)9.7(8.611.5)33.9(28.638.1)29.5(27.032.4)11日本730(590，820)14.9(1417)42.3(3647)9.4(7.611.3)26.4(2131)27.0(2530)30中国南京1070(9101190)15.1(13.617.6)47.6(3555)11.0(9.215.0)31.3(28.535)29.8(27.032.0)20镇江803.2(6031061)15.5(13.015.6)3
12、6.1(3242)12.0(8.015.3)23.1(17.128.3)29.4(26.031.2)40深圳602.5(489，842)13.7(10.415.6)35.7(2745)9.3(8.210.9)20.8(17.225.5)25.5(20.831.2)60台湾1174.9土78.613.01.639.1士3.410香港800.3(572967)15.3(13.016.9)37.4(3451)10.7(8.311.7)24.1(17.131.0)29.8(26.033.8)40线虫疫区 美国日本南京 镇江表2各疫区松材 线虫雌虫 测计 值N/条13402040中国深圳60Lm1029
13、.6Stm15.3a42b11.1C27.7V%73.7(7411235)(13.516.2)(3448)(9.812.6)(19.634.5)(71.675.7)81015.94010.22672.7(7101010)(1418)(3346)(9.412.8)(2332)(71.675.7)114015.239.411.127.372.9(6341529)(13.516.2)(3252)(9.612)(23.631.6)(7082.0)94815.63713.330.974.0(6341529)(15.416.9)(3145)(9.019.1)(24.438.9)(64.680.0)562.
14、214.43510.026.074.1(501583)(10.415.6)(3140)(8.411.8)(21.631.6)(68.882.8)台湾1257.282.514.33.341.0土3.376.1土0.1610香港844.2 (6241134)15.4(13.016.9)36.4(3042)11.3(9.414.1)21.6(23.246.3)75.2 (69.983.3)40表1各疫区松材 线虫雄虫 测计 值8.5 松材线虫和拟松材线虫的区别(见附录D)伞滑刃属中松材线虫和拟松材线虫(Bursaphezenchus mucronatus Mamiya & E，nd1a979)形态极
15、为相似，是鉴定时极易混淆的两种线虫，要注意 两者的区别(见表3)。表3 松材线虫和 拟松材 线虫主要形 态区别9 结果判定 以雌虫、雄虫的形态特征为依据，符合上述形态特征的，可判定为松材线虫。10 样品保留10.1 经鉴定为松材线虫的，则将剩余的线虫杀死、固定，放入含有线虫保存液(TAF液)的瓶中保存，也可制成永久玻片保存，并贴上标签。10.3需保留具有雌、雄成虫形态特征的显微照片各三张，雄虫包括：线虫整体，交合刺形状，端生交合伞形状；雌虫包括：线虫整体，阴门盖形状，尾部形状。10.2 对含有线虫的木样材料，经登记后妥善保存，并做好标识，标明基本情况，如截获日期、截获人、输出入国别地区、运输工
16、具名称等，木样 至少需保留六个月，以备复验。保存期满后视情况作销毁处理。(规范性附录)标准中 涉及的 试剂 配置方法A.1 TA倍液(三乙醇胺福尔马林双倍液)福尔马林(40甲醛)14 mL 三乙醇胺4 mL 蒸馏水82 mLA.2 棉蓝一乳酚油液配制含染料的乳酚油，按5X10-610X10-6的比例另加事先溶好的棉蓝水溶液。乳酚油的配制成分如下：苯酚(液体)500 mL 乳酸500 mL 甘油1 000 mL 蒸馏水500 mLA.3 福尔马林甘油液(PG液)福尔马林(40甲醛)8 mL 甘油2 mL 蒸馏水90 mLA.4 封片蜡由3份蜂蜡与1份凡士林融化后混合而成。A.5 PD养基(马铃薯
17、葡萄糖琼脂培养基)马铃薯200 g琼脂17葡萄糖10g 20 gg 20 g水1 000 mL将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1 000煮mL沸半小时，用纱布滤去马铃薯渣，加水补足1 000，mL然后加葡萄糖和琼脂。加热使琼脂完全溶化后，乘热用纱布过滤，或者用滤纸和保温漏斗过滤。而后分装试管或三角瓶，加棉花塞后灭菌备用。A.6 0.硫酸链霉素硫酸链霉素l g灭菌水1 000 mL附录B(规范性附录)松材线虫分 离方法B.1 漏斗分离法将漏斗(直径10 C15 cm架在漏斗架上，下面接一段10 c的橡皮管，橡皮管上装一个截流夹(图B.1)。具体操作步骤如下：将10木g 屑或细木片用双重纱布包好，放
18、在盛满清水的漏斗中(由于线虫的趋水性和自身的重量，线虫离开植物组织，在水中蠕动，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中)；24后h 打开弹簧夹，用离心管或小瓶接取约5 m的水样；静置20 mi左右或1 500 rmin离心3 mi 倾附录A去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。用此方法分离松材线虫时，分离时温度应保持在25左右。温度太高或太低均会影响松材线虫的分离效果。B.2 浅盘分离法浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘、线虫滤纸或宽幅卫生纸组成。一只浅盘口径小，可套放于另一只浅盘内，并且其底部用粗筛网(10目)取代， 被称为筛盘；另一只是正常浅盘(图B.2)。将线虫滤纸或1层2层卫生纸平铺在
19、筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的木屑或薄木片放置其上；从两只浅盘的夹缝中注水，至淹没供分离的材料为止；在25左右下放置12目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到小培养皿中镜检。1样品；2线虫滤纸；3筛盘；4底盘。h 24后h ，用烧杯收集浅盘中水，并将烧杯中的水连续通过40目和500目的套筛，将500图B.2浅盘法分离线虫装置示意图。B.3 改进型漏斗法改进型漏斗法分离松材线虫，包容了浅盘法和漏斗法各自的优点，在提高了漏斗法分离效率的同时，又解决了浅盘法必须使用套筛而使树脂及杂 物经常堵塞500目筛的筛孔的问题。改进型漏斗法分离装置，由1只较大并类似于贝尔曼漏斗的玻璃或有机
20、玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘法装置相似(见图B.3)。 将线虫滤纸或1层2层卫生纸平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分；将待分离线虫的木屑或薄木片(2 m左右)放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注入分离器中，以淹没供分离的材料为止；在1525下放置1d 2后d ，打开弹簧夹，用离心管接取约5 m的水样；静置20min左右或1 500 rmin离心3 mi，吸去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。1样品；2线虫滤纸；3筛盘；4基座；5橡胶管；6截流夹。图B.3改进型漏斗分离松材线虫装置示意图附录C (资料性附录)松材线虫培 养、标本制作和虫体 测计 方法c.1 松材线虫
21、培养方法当分离得到的松材线虫数量较少或未分离到雌雄成虫时，可通过培养获得大量成虫，进行进一步鉴定。C.1.1 病木保温保湿培养将样品锯成小段，置于烧杯中加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在25条件下保温保湿培养3d 4，d 倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫；或将样品木段适当浸湿，放于塑料袋里，扎紧袋口，置于25培养箱中3d 4取d 出重新分离，可获得较多雌雄成虫。C.1.2 单异活体培养用灰葡萄孢(Botrytis cinere)a或多毛孢 (Pestalotia sp养线虫。以灰葡萄孢为例：制取马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)培养基平板。挑取PDA斜面上的一小块灰葡萄孢，移
22、在PDA平板上，保持25恒温及黑暗条件，经4d 5菌d 丝长满平板。在长满灰葡萄孢的PDA平板上接种经0.1硫酸链霉进行表面消毒的2条以上的幼虫，在25恒温箱中培养5天可获得足够用于鉴定的线虫；10天左右，可繁殖产生大量线虫。C.2 松材线虫标本制作方法c.2.1 临时标本解剖镜下用线虫挑针挑取线虫，转移至玻片上的25L水滴中，使线虫沉底并位于水滴中央。在水滴边缘放置3 m5 m 、直径略大于线虫体宽的玻璃纤维丝二根至三根。从水滴正上方加盖玻片，在酒精灯火焰上用1的水渍干燥后，用透明指甲油封固，30 mi后加封一次。C.2.2 半永久标本的s 振幅周期通过10次20次，使线虫恰好被杀死为止。待
23、盖玻片周围溢出将分离所得的线虫液，转移至离心管中，2 000 rmin离心3 mi。吸去上部清水并保留底部3 m 4 m虫液，置于53热水中15 mi 死线2 mL3 mL棉蓝一乳酚油的钟面皿中，置恒温烘箱中45脱水24 。h虫，待线虫液冷却后，加入等体积的TAF双倍液固定48以h 上。固定后用上述方法再次离心，用50 L微量移液器吸取离心管底部线虫液，滴加进装有松材线虫标本后贴上标签，注明标本中松材线虫的虫龄、数量、寄主、寄主产地、截获口岸及鉴定人等。C.2.3 永久标本同上述方法杀死、固定线虫后，用“甘油缓慢脱水法”制作松材线虫永久玻片。在钟面皿培养皿内注入2 m3 m 尔马林甘油液，在其
24、中加在载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加一小滴甘油于蜡圈中心位置。解剖镜下挑取脱水后的目标线虫于甘油中，使其沉底并位于甘油滴中心位置。 在封片蜡圈上放置盖玻片后，转移至控温电热平板上，保持75使蜡完全融化，取下并自然冷却后用透明指甲油加封一次。在显微镜下鉴定并确认为2滴苦味酸饱和液制成脱水液，用微量移液器吸离心后的离心管底部线虫液50 L，滴加在上述脱水液中。以同样的小染色皿盖好线虫皿后，放置在43温箱中或干燥皿中6周8周，让水和甲醛等缓慢蒸发，期间由于皿中的水和福尔马林的蒸发，需要及时补充在同一温箱中预热的甘油福尔马林液。在不断“蒸发一补充”过程中，皿内的甘油愈积愈多，线虫体内的水分愈来愈少，直
25、至线虫完全脱水为止。脱水后的线虫用C.2.2中方法制片并加贴标签。C.3 松材线虫虫体测计方法本标准采用德曼公式(De Man formul对a)松材线虫进行虫体测定，具体测定项目和方法如下：N标本数； L体长(mm或m，头端至尾端的中线距离，不包括尾尖突)； a体长除最大体宽； b体长除自头端至食道与肠的连接处的长度； c体长除尾长(门或泄殖腔口至尾端，不包括尾尖突)； V头端至阴门的长度乘100除体长；. T睾丸长度乘100除体长；St口针长度；sp交合刺长度。附录D (资料性附录)松材线虫和 拟松材 线虫鉴别 方法可以依据以下方法鉴定和区别松材线虫和拟松材线虫(见图D.1)：松材线虫雌虫和幼虫尾部基本无尾尖突，有时部分出现的尾尖突，也不超过2 m，且位于尾部正中间；而拟松材线虫尾部尖、或有3 m左右有时可以更长的尾尖突；有尾尖突类型的拟松材线虫尾尖突常常偏生于虫体背部。松 材线虫雄虫交合伞呈卵圆形，一般末端尖；而拟松材线虫雄虫交合伞末端呈月牙铲形。松材线虫雄虫交合刺末端有明显盘状突；而拟松材线虫雄虫 交合刺末端尖利。
