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1、高效液相色谱法,以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。以高压泵输送液体流动相，采用高效固定相，实现在线检测和仪器化。具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等的优点。,第一节 概述,与气相色谱法对比,GC 快速、分离效率高、样品用量少。在约300万个有机化合物中，可以直接用该法分析的占20%。HPLC 快速、分离效率高、样品不受挥发性及热稳定性的约束，因而分析对象广。,与经典液相色谱法的比较,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,LLC和LSC分配、吸附、离子交换和空间排阻化学健合相色谱法 ISC和PIC/IPC,二、化学键合相色谱法,将固定液的官能团键
2、合在载体的表面构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为键合相色谱法。键合相色谱法是应用最广的色谱法。,键合相色谱法,正相色谱法反相色谱法,RHPLC ISCPIC or IPC,（一）正相键合相色谱法,固定相：氰基、氨基化学键合相。氨基键 合相色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱。流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂 分离机制：范德华作用力（定向力、诱导力或氢键）,流动相的极性与容量因子的关系：流动相极性，洗脱能力，k，tR,（二）反相键合相色谱法,常用固定相：十八烷基硅烷（C18，ODS）常用流动相：甲醇水，乙腈水分析对象：非极性、中等极性的分子型化合物分离机制：疏溶剂理论认为在该法中溶质的保
3、留是溶质分子与极性分子间的排斥力。,反相键合相色谱法,影响保留行为的因素溶质的分子结构 极性，疏水性，k，tR 流动相 与其表面张力和介电常数有关，有机溶剂含量，k 流动相的pH影响溶质的离解程度，离解程度，k固定相 随碳链延长，键合相疏水性，k 碳链一定时，键合相浓度，k,离子抑制色谱法 ISC,ISC调节RLLC流动相pH值以抑制组分的离解 抑制剂：弱酸(HAc)、弱碱(NH3H2O)或缓冲液 分离机制：调节流动相pH，抑制组分的理解，以中性分子的形式在固定相和流动相之间产生分配平衡。分析对象：3.0pKa 7.0的弱酸 7.0 pKa 7.0的弱碱 两性化合物,ISC,容量因子及其影响因
4、素 对于弱酸：流动相pH 组分pKa，k，tR流动相pH范围2 8固定相与反相键合相一致,（三）反相离子对色谱法,RPIC在一般RLLC流动相中加入离子对试剂。常用的离子对试剂：分析碱用烷基磺酸盐，分析酸用四丁基季胺盐。分离机制：离子对试剂与被分析的离子形成中性离子对，在固定相和流动相之间产生分配平衡。分析对象：各类有机酸、碱、盐及两性化合物,保留机制-离子对模型,B+H BH+,RSO3Na,RSO3-,+Na+,+,BH+RSO3-,固定相,BH+RSO3-,影响容量因子的因素,离子对试剂的种类和浓度 分析酸性类物质 季铵盐 分析碱性类物质 烷基磺酸盐或硫酸盐 PIC试剂碳链，k 在低于胶
5、束浓度时，PIC试剂浓度，k流动相的pH 影响PIC试剂和组分的离子化,小结,三、其他高效液相色谱法,离子色谱法（ion chromatography）手性色谱法（chial chromatography）亲和色谱法（affinity chromatography）,离子色谱法（ion chromatography）,离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法 抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）,分离柱 交换反应：ROH+NaX RX+NaOH洗脱反应：RX+NaOHROH+NaX抑制柱 与组分反应：RH+NaXRNa+HX与洗脱剂反应：RH+NaOHRNa+H2O,第二节 HPLC的
6、固定相和流动相及其选择,固定相应满足下列要求颗粒细、均匀传质快机械强度高，耐高压化学稳定性好，与流动相不发生反应,一、化学健合相的固定相（chemically bonded phase),用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上所形成的填料称为化学键合相。按极性分为非极性、中等极性和极性三类。,（一）键合相的种类1.非极性键合相,表面基团,-C18H37-C8H17,2.弱极性、极性键合相,弱极性键合相：O 正相和反相均可 极性键合相：CN NH2 一般作正相,（二）键合相的性质和特点,键合反应含碳量和覆盖度 键合基团的链长增加，极性降低，载样量增大，容量因子增加。键合相的特点 不流失
7、、稳定、载样量大注意点 pH适用范围,二、化学键合相的流动相,对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。有合适的k值。溶剂应与检测器相匹配，溶剂的截止波长样品的检测波长纯度高，粘度小。,流动相对分离的影响,分离度R与n、k2的关系 n-决定于色谱柱（固定相）性能。、k-受溶剂系统（流动相）影响。,增加,溶剂洗脱强度增加,柱效增加,溶剂的强度和选择性,溶剂的极性 可按Snyder溶剂系统中的强度因子来表示，反相洗脱时，强度因子S越大，洗脱能力越强。溶剂系统选择的原则(分子间作用力)与优化意义(增加R)流动相的优化 实现最难分离物质对的理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分
8、离效能前提下的快速分离,三、分离条件的选择,（一）Van Deemter 方程式 在气相色谱法中：填充柱 毛细管柱在HPLC中：,H=A+B/u+Cu,H=B/u+Cu,H=A+Cu,在HPLC中,纵向扩散项 B=2Dm Dm T/B/u减小至忽略不计涡流扩散项 A=2dp 降低 降低dp 传质阻力系数 C Cm+CsmH=A+Cu=A+Cmu+Csmu 近似认为流动相的流速与板高成直线关系，流速增大，板高增加，柱效降低。一般采用1ml/min。,固定相粒度对板高的影响,Cm=dp2/Dm dp固定相微粒直径小粒度、均匀的球形化学键合相低粘度流动相，流速不宜太快柱温适当,（二）正相键合相色谱法
9、的分离条件,固定性极性流动相极性固定相：极性键合相 流动相：烷烃（底剂）+极性调节剂 正相洗脱时，依靠组分的极性差别而分离出峰顺序：极性小的组分先出峰。,（三）反相键合相色谱法的分离条件,流动相极性固定相极性固定相：非极性键合相 流动相：甲醇-水、乙腈-水，常加入弱酸、弱碱或缓冲盐调节流动相pH以抑制组分离解，增加保留 反相洗脱时，出峰顺序：极性大的组分先出峰。,（四）反相离子对色谱法的分离条件,离子对试剂的选择流动相pH的选择有机溶剂及其浓度的选择,四、其他固定相,键合型离子交换剂手性固定相 分析、分离对映体的最重要手段。制备单一构型的活性异构体是世界制药业的大方向。亲和色谱固定相 虽然并非新方法，但近年来有了长足的发展。利用亲合反应的专属性，该法已成为生化药物纯化、分析的重要手段。,亲和色谱固定相举例,氨丙基硅胶 间隔臂 CMP,固定相可用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶等多种蛋白质的纯度分析。,
