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1、第二节 其他氨基酸发酵,氨基酸的生物合成,氨基酸生产工艺,按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：1.谷氨酸族（-酮戊二酸族）谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；2.丙酮酸族：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；3.天冬氨酸族（草酰乙酸族）天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；4.磷酸甘油酸族:甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；5.芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。,氨基酸生物合成的调节机制,反馈抑制与优先合成 氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与在合成途径分支点处的优先合成。反馈抑制：ABCD E D 优先合成：ABC F G,2）顺序控制 E D ABC F GA
2、 B C D,1）终产物控制 催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况：协同（或多价）反馈抑制 合作（或增效）反馈抑制 同功酶控制 积累反馈抑制,一、赖氨酸发酵,我国赖氨酸主要生产单位及生产能力,谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌突变类型：缺陷型、敏感型、抗结构类似物和组合型突变株。,1.天冬氨酸族生物合成途径,天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。甲硫氨酸 琥珀酰高丝氨酸 合成酶草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸-半醛高丝氨酸苏
3、氨酸 DAP合成酶 异亮氨酸 二氨基庚二酸赖氨酸,2.天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制,在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1）大肠杆菌K12(同功酶调节)天冬氨酸激酶(三个)天冬氨酸-半醛脱氢酶(两个)DAP合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）高丝氨酸合成酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）,2）黄色短杆菌(协同反馈抑制)赖氨酸生物合成调节机制中天冬氨酸激酶只有一种。3）乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节,微生物赖氨酸合成途径不同：1）为经过二氨基庚二酸的生物合成途 径，如细菌，DAP；2）是AAA，酵母菌、霉菌经过-氨基己 二酸AAA途径合成赖
4、氨酸。,3.赖氨酸生产菌的育种途径,出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）1）优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。2）切断支路代谢：营养缺陷型的选育。3）抗结构类似物突变株的选育（代谢调节突变）。,4）代谢互锁 解除代谢互锁的方法：选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼亮氨酸缺陷型菌株。选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸对DAP合成酶的阻遏。选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。,5）增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成 6）改变细胞膜的透过性7）选
5、育温度敏感突变株8）应用细胞工程和遗传工程育种9）防止高产菌株回复突变,4.赖氨酸发酵条件控制,溶氧：不足，赖氨酸 生产受到不可逆抑制；PH：补加氨水；温度：32；前体：甘氨酸或丝氨酸。（短小假单胞菌）,二、苏氨酸的发酵生产,具有多重标记的缺陷型菌株苏氨酸结构类似物抗性菌株（AHVr）,三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺,1.异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径：图23-4,2.异亮氨酸发酵,两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法添加前体发酵法：苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制；添加前体物质D-苏氨酸、-酮基异戊酸；绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。直接发酵法：抗反馈调节突变株，解除对苏氨酸脱水
6、酶的反馈抑制。,四、新种分离与筛选的步骤,调查研究（包括资料查阅）试验方案设计 含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）样品预处理 菌种分离,根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法 随机分离方法(定向筛选选择压力)(用筛选方案-检测系统进行间接分离）富集液体培养 固体培养基条件培养(初筛)菌种纯化 复筛,菌种纯化 初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试 较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和 或作为育种的出发菌株 毒性试验等,含微生物样品的采集,采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度,样品的预处理,目的：提高分离效率
7、方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法诱饵法,分离方法的选择,根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离,选择性分离,选择性分离原理和技术,生长条件的选择与控制原理控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术,施加选择压力，进行定向筛选,A.富集液体培养,增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（max）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（）筛选,A,B,S0,基质浓度对A
8、、B两种菌的比生长速率（）的影响 当SS0时，富集什么菌株？,B.固体培养技术,常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质,随机分离原理与技术,从产物入手，设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。,高产培养基设计的几个原则,制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。,生长因子产生菌的筛选,筛选
9、模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长,氨基酸产生菌的筛选,样品 预处理 初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应 u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈,目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定,筛选产物含量高的菌株,菌种选育改良的具体目标,提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品,五、代谢工程,利用多基因重
10、组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。又称作途径工程，是多基因的基因工程。,代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。,根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点：解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。,（一
11、）代谢工程发展基础,相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。S I P S P B B1 B2,相依网路,独立网路,（二）代谢工程育种思路,1.改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向（3）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径,2.扩展代谢途径（1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。（2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。,3.转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径:为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构建新的代谢途径:利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。,
