农业微生物学实验ppt课件.ppt

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1、农业微生物学实验课,生命科学学院 侯春,课程简介,训练学生的农业微生物学基本实验技能 实验内容 常见的器皿、工具和仪器设备 无菌操作技术；培养基的制备&消毒灭菌技术 土壤微生物（固氮菌）的分离培养纯化技术微生物制片染色技术 微生物在农业上的应用实验目的学生掌握农业微生物学的最基本技能要求,主要参考书,沈萍，范秀容，李广武主编微生物学实验（第三版）北京：高等教育出版社，1999杜连祥，路福平主编微生物学实验技术M北京：中国轻工业出版社，2005周德庆微生物学实验教程（第2版）M北京：高等教育出版社，2006杨文博主编微生物学实验M北京：化学工业出版社，2004赵斌，何绍江主编微生物学实验M北京：

2、科学出版社，2002东秀珠，蔡妙英主编常见细菌系统分类和鉴定方法M北京：科学出版社，2001,实验课内容介绍,农业微生物实验要求及安全须知、环境、人体表面微生物的检测从土壤中分离各种类群微生物（重点：固氮菌的分离）几大类群微生物个体形态观察 微生物在农业上的应用固氮菌的分离鉴定 土壤中氨化细菌的测定 植物病原菌的分离鉴定（自主选做）,实验一农业微生物学实验课介绍与安全教育,实验课的目的,掌握农业微生物实验的最基本操作技术相关技术得到充分训练（熟练掌握最好）读、想、学、会、用,实验课的具体安排和要求,实验课学习要求实验过程的要求实验课安排良好的实验习惯实验报告的形式成绩的评定及组成,实验课学习要

3、求,认真对待，做好预习，加强自主抛砖引玉，增强学科联系多发现问题，多和教师交流注重原理，努力创新做到“读、想、学、会、用”,实验过程的要求,实验过程注意安全（具体介绍）操作时要预防空气对流接种时不要走动和讲话认真做好环境卫生，做到“干干净净进来，干干净净出去”进出实验室要洗手,实验课安排根据教学计划，本门实验课程1.5学分，3学时/周，14周共42学时，每学时45分钟，每次课3小时；实验结果的观察是实验过程的重要内容。分组2-4人一组，登记联系电话；穿白色实验服进入实验室；每组准备记号笔和打火机各一个；值日生由班委每次实验前委派；,良好的实验习惯不迟到，不缺席，有事提前请假；迟到5分钟以上以缺

4、席计入实验习惯成绩；爱护实验用具；实验完成后认真清洗实验用具，并摆放整齐；离开实验室要经教师检查同意方可离开；认真做好值日生工作，有人具体负责安排检查。,实验报告的格式,实验目的实验原理实验材料和器材实验方法和步骤实验结果、数据分析讨论及思考题,实验报告要求 1.每位学生准备规定式样的实验报告纸。2.上课时每给出一次作业，就在下一次上课前上交这一次的实验报告，不得拖延时间 3.报告要求写清楚实验目的、原理、步骤、结果及思考题。希望简洁、工整 4.本门课结束前，要求使用统一的封面，把自己的所有实验报告按实验先后顺序装订成一册，交给实验教师,实验课成绩平时成绩（20%，安排于实验过程中或 期末进行

5、操作考核）实验习惯（10%）期末考试（20%，笔试考试）实验报告（50%）可能组织就实验内容进行答辩，替代期 末考试,实验用到仪器设备,显微镜（光学普通、相差、微分干涉差、暗视野；电子扫描、透射）；高压蒸汽灭菌锅（立式和卧式）；超净工作台、隔水式恒温培养箱；鼓风恒温干燥箱；恒温振荡培养箱（旋转式和往复式）；旋涡振荡器；恒温水浴锅；pH计；分光光度计（紫外、可见光、红外、原子吸收等）；离心机；冰箱；微波炉等。,实验用到器械,试管（test tube）德汉氏小管（Durham tube）小塑料离心管，又称Eppendorf管 玻璃吸管（glasspipette）微量吸管（micropipette）

6、微量加样枪 培养皿（petri dish）三角烧瓶（erlenmeyer flask）,实验用到器械,载玻片（slide）和盖玻片（coverslip）滴瓶(dropper bottle)接种工具接种环、接种针、接种钩、接种铲、接种刀、涂布器（玻璃或不锈钢制作）等。,常见的接种工具（可根据要求自已定做）,常用玻璃仪器,实验室安全,实验教学过程中出现的各类突发事故和事件主要有：1、火灾；2、触电；3、跑（漏）水；4、化学品伤害及中毒；5、灼伤；6、割（划）伤。,实验室安全,事故处理要求先保护好自身的安全，再施救不要慌张，按安全预案处理认真负责，不推缷责任逐级上报，不隐瞒事故,化学药品及溶剂的处理

7、方法,1.在使用强酸或强碱时必需戴上安全手套，并戴上安全眼镜。2.有机溶剂，固体化学药品，酸、碱化合物均需分类存放，挥发性之化学药品更必需放置于具有抽气装置的药品柜内。3.高挥发性或易于氧化之化学药品必需存放于冰箱或冰柜之中。4.强酸或强碱（包括废酸碱）不得存放于金属架之上。,安全用电 防止事故,1.了解实验室总电源开关的安装位置。2.不可用湿手操作电器，使用电工工具前确认其完好无损。3.严禁在实验室内私自接用电源。4.确保漏电保护器起作用，用电器外壳接好地线，实验室无人时要切断电源。5.遇有电器失火，先要切断电源，再行灭火。6.人身触电，立即人工呼吸，再送医院，切忌打强心针。,节约用水 防止

8、跑漏,1.不用水时，随手关闭阀门。2.废物废液不准倒在水槽内，实验完了放水冲洗水槽和下水管，勿使废液残留其中。,安全使用药品 防止中毒,1.使用化学药品前，要充分了解其化学性质、物理性质和使用注意事项。2.不能尝化学药品，也不能直接去闻化学药品，避免用手直接去接触药品；使用药品和实验结束后立即用肥皂水洗手。3.尽量不可在实验室进餐。4.有毒或带剌激味的实验要在通风橱内进行，实验期间要开排风扇，或开窗通风。5.做好废液处理，防止环境污染；发现中毒现象，及时对症治疗，必要时送医院。,实验时需特别注意：人身安全 防止割伤、灼伤，如有发生，应用急救药品施治,意 外 对 策,学生衣服着火的对策,以灭火毡

9、包裹该同学，并使其在地上滚动其他同学立刻通知老师。,实验室的窗帘布着火的对策：,取出灭火器，拔出安全针。把喷咀对准火源。按掣使灭火器喷出二氧化碳。其他同学立刻通知老师。,酒精溅在实验桌上并着火的对策：,利用沙桶或湿抹布把燃烧的液体用沙盖着。其他同学立刻通知老师。,学生打破了烧杯，被碎片割伤流血的对策,以清水冲洗伤口。贴上干净的消毒胶布。其他同学立刻通知老师。,化学药品溅进学生的眼睛内的对策,用洗眼瓶以大量清水冲洗眼睛。其他同学立刻通知老师。,一个学生在倾倒酸时意外地接触到酸的对策,立刻以大量清水冲洗患处最少五分钟。立刻通知老师。,实验物品常见警告标识符号,灭火器及其使用方法,实 验 二实验室环

10、境及人体表面 微生物的检测,一、目的要求 检查实验室空气中及各人手上的微生物(细菌为主)，并加以统计、比较和描述（数量、菌落形态等）。使学生认识到微生物无处不在，以便在以后的实验中重视无菌操作。,二、实验原理微生物广泛分布于室内外、水、空气和土壤中；通过对环境和人体表面微生物的检测及观察，建立起“微生物无处不在、无孔不入”的概念。形成自身良好的卫生习惯，认识到在微生物实验中无菌操作的重要性。,平板培养基含有微生物生长所需的营养成分，当不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，12天内每一菌体细胞即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个肉眼可见的细胞群体（菌落）；每种微生物都有其特有的菌

11、落形态，一般情况下一个菌落对应一个微生物活细胞，这样就可以统计不同微生物在某样品中的数量。,三、实验材料及器材,牛肉膏蛋白胨培养基平板 3个/组；洗手液、酒精灯、记号笔、恒温培养箱等。,四、实验方法及步骤,（一）实验室空气中微生物检查（二）手上微生物检测,1、取一无菌牛肉膏蛋白胨琼脂平板，打开上皿盖（皿盖扣放，开始计时），使培养基暴露于空气中30分钟，盖上皿盖。2、在37下倒置培养2448小时，观察结果，统计微生物数量。,（一）实验室空气中微生物检查（沉降法）,3、利用沉降法测定计算空气中微生物的数量，结果的表示的方法有两种：一种是每一平皿上菌落形成单位;另一种是每一平皿实测得的菌落形成单位，

12、再按奥梅梁斯基公式换算成为每立方米多少个细菌。,根据前苏联奥梅梁斯基提出的建议：面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的菌落数。具体计算公式如下：,除沉降法外，常用还有撞击式（有专门仪器设备）。多级撞击式空气微生物采样器,1、取一个牛肉膏蛋白胨琼脂平板，用记号笔在平板底部（外面）划线等分成2半，用手指在其中一半上印（或摩擦）几下（不能把培养基划破）；然后用肥皀洗手，用同一手指在另一半上印（或摩擦）几下。2、在37下倒置培养2448小时，观察结果，统计比较洗手前后的微生物数量及菌落种类。,（二）手上微生物检测,（三）菌落特征描写方法 大小 大、中、小、针尖状。可先将

13、整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。干湿情况 干燥、湿润、粘稠 形态 圆形、不规则等 高度 扁平、隆起、凹下 透明程度 透明、半透明、不透明 边缘 整齐、不整齐,本次实验的思考题,1、将你在平板上观察到的结果填入下表,2、计算出相应的空气中微生物数量？3、洗手前后的手指平板，菌落数有无区别，为什么？如果想定量测定人体某部分皮肤上的细菌如何操作？4、通过本次实验你有什么感受体会？5、根据已做过的实验，谈谈实验室安全需要注意的事项。,下周的实验内容,实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌重点：培养基

14、的概念、分类、配制过程及注意事项；相关器皿的规范包扎及要求；消毒、灭菌的概念和方法，灭菌器的使用。,实验二培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌,实验的目的&要求,明确培养基制备原理通过对培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤了解消毒、灭菌的原理及方法，掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌学习并练习相关器皿的包扎方法,内 容 一培养基及无菌水的制备,一、培养基的相关知识介绍,1、培养基的定义和组成培养基：指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养基质（反映培养基的2个作用？）。包括六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、能源、水。,2、培养基制备原则和方法,四个原则：目的明确；

15、营养协调；物理化学条件适宜；经济节约C/N：指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比四种方法：生态模拟；参阅文献；精心设计；试验比较,3、物理化学条件适宜的说明,pH值：渗透压和水活度（aw）：在同温同压下，某溶液的蒸气压（P）与纯水蒸气压（P0）之比。氧化还原电位：针对厌氧菌分离特别需要注意（半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等）,4、培养基的分类,（1）按成分分对成分种类、量是否清楚 天然培养基 合成培养基（组合培养基）半合成培养基（也称半组合培养基）（2）按物理状态分 固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固体基质的使用）半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.

16、7%）液体培养基（工业生产中的重要性）脱水培养基（也称预制干燥培养基）,（3）按培养基对微生物的功能分基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基本营养物质。选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。“投其所好、取其所抗”。高通量筛选的建立。鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。直观、专一性（伊红美兰培养基，EMB）,大肠杆菌在EMB培养基上的形态,二、培养基的配方,一个实验班共配

17、置3种固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基高氏1号培养基马丁氏培养基按照老师的划分进行，每个实验小组都要准备，几个实验小组配1种培养基，供全班使用,1、牛肉膏蛋白胨培养基（分离、培养细菌用）500ml/组,牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000ml琼脂 1520g（本次用15g）pH 7.47.6,可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO43H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g 琼脂 1525g(本次用15g）水 1000ml pH 7.47.6 临用时无菌操作在800ml培养基中加入3%的K2Cr2O

18、7溶液1ml,2、高氏1号培养基（分离、培养放线菌用）500ml/组,KH2PO4 1 gMgSO47H2O 0.5 g蛋白胨 5 g葡萄糖 10 g琼脂 20 g水 1000mlpH 6.0配好后在此培养基中，按1000ml加入1%孟加拉红水溶液3.3 ml。临用时以无菌操作在100ml培养基中加入1%的链霉素0.3ml，使其终浓度为30ug/ml。,3、马丁氏培养基（分离、培养真菌用）500ml/组,三、培养基配制的步骤,1、计算 按照配方要求（一般为1000ml的量）和实际配制培养基的量，计算出不同组分需要的量。,2、称量、溶解 按培养基配方在三角瓶中先加水（如无加入后大幅度改变原体积的

19、物质，可以把水加足），然后依次准确称取各药品并分别逐一溶解于其中（琼脂需加热溶解），最后补充水到所需体积。（注意：各成分之间发生化学反应产生不溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸的显色的物质，调pH值后再加入）,3、调pH 用510%NaOH、15%HCl溶液将培养基的pH调到所需范围，根据需要用精密pH试纸或pH计来确定。4、包扎（有一定规范要求）5、灭菌（高压蒸汽灭菌：121.3,1530min）,四、培养基配制过程中需注意的事项,先加水易产生沉淀逐一溶解易产生沉淀调节pH容易忘记加塞灭菌（或过滤除菌）即时灭菌煮过或加热过培养基，注意水的蒸发补足,五、培养基配制中的2点说明,1、量微的药品

20、（天平无法称量），以溶液形式加入（先配制成一定浓度的溶液）；2、粘稠的药品和物品，称好后与称量纸一起放入溶液中，待药品溶解后取出称量纸；或利用减称量法完成（从总药品量中以减量称出所需要的量）。,六、无菌水的准备,经灭菌处理后的蒸馏水或自来水。1、量取90mL蒸馏水在250mL三角瓶，内加玻珠 1瓶2、吸取9mL蒸馏水在18*180试管中 6支包扎后灭菌。,注意！,标记（记号笔）写在器皿壁或外包装纸上（如还需要高压蒸汽灭菌，只能写在外包装纸上）；不要直接写在瓶（管）塞或包装棉布上。,内 容 二消 毒 与 灭 菌,一、消毒、灭菌的定义和常见方法,消毒：指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌：指杀灭

21、一切微生物的营养体、芽孢和孢子。常见方法：加热法：包括干热灭菌和湿热灭菌 过滤除菌 辐射灭菌 化学药品灭菌,高温灭菌或消毒的方法,过滤除菌技术（正压和负压之分）,滤膜过滤器微孔滤膜（醋酸纤维、硝酸纤维、火棉胶、有机大分子物质），孔径0.22和0.45um。玻璃滤器玻璃粉烧结板（G1G6）蔡氏（Seitz）滤器多层石棉纤维板（整体为金属制成）其它（不常见）陶瓷、硅藻土制滤烛形：张伯伦（Chamberland）滤器 伯克菲尔德（Berkefeld）滤器 曼德勒尔（Mandler）滤器,膜过滤装置,不耐热的液体培养基的除（灭）菌,膜过滤装置,细菌截留于膜过滤器滤膜表面,二、加热灭菌的方法,1、干热灭

22、菌法：火焰灼烧法 烘箱内热空气灭菌法2、湿热灭菌（消毒）法：常压下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；间 歇灭菌法。加压下：常规加压灭法；连续加压灭菌 法。,三、干热灭菌,火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种方法通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160170）进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（吸管、培养皿等）的灭菌,干热灭菌需要注意的事项,不能对塑料器皿和培养基灭菌；控制好温度和时间（160180，2小时），防止包扎的报纸焦糊；灭菌过程（未完全冷下来，60 以下）不要打开烘箱门，防止报纸着火或玻璃器皿遇冷爆裂。,四、高压蒸汽灭菌锅的结构及使用,高压蒸汽灭菌的原理,高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽

23、（潜热）对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用造成蛋白质等变性失活。潜热是指当1g100的水蒸汽变成1g100水时，释放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的热量。各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、自动排放冷空气、程序化显示）饱和蒸汽压压力指示温度直接利用温度探测器指示温度,典型的高压蒸汽灭菌锅纵剖面结构,卧式灭菌锅示意图（简图）,立式压力灭菌器,手提式灭菌锅,卧式矩型和圆型压力蒸汽消毒器,高压蒸汽灭菌过程：,1、取出内筒，检查水位；2、加水至淹过电发热管和内筒支架；3、放入内筒，并在其中放入需灭

24、菌物品（要求松散）；4、加盖（对称旋紧），打开放汽阀；5、加热（有内外两种），升温；6、排除冷空气由放汽阀冒汽35分钟；7、关闭放汽阀（有些灭菌锅灭菌过程中一直保持较小排气或到一定温度自动关闭），加压升温至所需温度或压力；8、保温定时至所需时间；9、不再加热，降温至压力表为“0”，打开放汽阀；10、开盖取物（注意蒸汽烫伤）。,空气排除度对灭菌温度的影响,一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间,消毒、灭菌的生物指示菌,嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）结核分枝杆菌致病菌指示菌（Mycobacterium tuberculosis沙门氏菌致病菌指示菌（通用检测）（Sa

25、lmonella spp）,高压蒸汽灭菌效果的监测方法（3种）,1、工艺（程序）监测压力表、温度计等，最常见，每次都使用；2、化学指示监测 特定化合物熔点（熔化前后晶体形态不同，硫磺熔点115、乙酰替苯胺116、脱水琥珀酸120、苯甲酸122.4等结晶）、灭菌指示胶带（变色反应）；3、生物指示剂监测 特定微生物（需经培养）。,五、实验室常用灭菌方法,1、高压蒸汽灭菌常用121.3，20min和115，10min两种条件进行；适用于耐热性溶液、培养基和水的灭菌；2、热空气干热灭菌160170，2hr；适用于玻璃器皿和金属工具的灭菌；3、灼烧灭菌酒精灯和电加热，适用于接种工具的灭菌；4、过滤除菌现

26、在一般使用微孔滤膜（0.22m或0.45m），适用于非耐热性溶液和培养基的过滤除菌。,内 容 三相关器皿的包扎方法,一、器皿包扎的作用,1、湿热灭菌时防止冷凝水的污染；2、灭菌后可以长期放置，保持器皿等的无菌状态和防止灰尘的污染。,二、相关器皿的包扎要求,利用报纸、牛皮纸或专用器械包扎，重点练习报纸包扎。1、培养皿的包扎 双层大报纸、12套包扎成1包2、吸管的的包扎 吸管先塞棉花（松紧适度），利用宽5cm左右的长条形报纸裹扎3、试管和三角瓶的包扎4、涂布器（刮子）的包扎,三、包扎中的几点说明,包扎纸大小适中，器皿或器材不外露，塞子、纱（棉）布、瓶口、管口等不外露。包扎试管和三角瓶时，包扎线向下

27、一点，不要扎在塞子上。装有培养基等液体的容器，包扎过程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和内装液体不准。,四、利用吸管筒（铜制或不锈钢制）包扎吸管灭菌,不锈钢吸管筒、培养皿筒,本次实验完成的内容,1、90mL无菌水1瓶（250mL三角瓶，内加玻璃珠）2、9mL无菌水6支（18180试管）3、1mL无菌吸管6支4、培养基瓶（500mL，三种之一）5、9cm培养皿1包（12个）6、涂布刮子4支,思考题,1、在配制培养基的操作过程中应该注意些什么问题？为什么？2、高压蒸汽灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排净？灭菌完毕后，为什么要待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？,下周的

28、实验内容,实验三 微生物的分离和纯化要点：无菌操作技术的概念、重要性及实现方式微生物的分离和纯化的原理和方法,实验三 微生物的分离和纯化,目的要求,掌握一定的无菌操作技术（包括上次实验中培养基及实验用具的灭菌），了解无菌（洁净）空间的实现手段和方式。掌握倒平板、制斜面的技术和方法。掌握几种分离纯化微生物的原理及基本操作技术和方法,基本概念,菌落单个细胞（孢子）或少数几个同种细胞（孢子）在固体培养基上，经过适当培养后，形成肉眼可见的具有一定形态特征的细胞群体。菌苔若干菌落（同种或不同种）聚集在一起，不可分，无一定形状形态特征。稀释倍数溶液经过定量稀释后可以计算的倍数，一般用于CFU/ml计算。稀

29、释度稀释倍数的倒数，标记和表述时用。,污染来源,空气（空间）实验室、车间、生产场所等；实验用器材实验用具、器皿、器械、试剂、药品等；实验材料实验用材料和样品本身携带；人体衣服、毛发、皮肤表面、和外界相通的腔道等,无菌操作技术的概念,指防止微生物进入机体或其他物品的操作技术，具有两方面的要求。防感染针对生物体（包括操作者）。防污染针对培养物、实验所用物品和实验室空间等。针对人来说，还要解决防止双向交叉感染操作的问题人对培养物等的污染；培养物对人的感染。实验室中如何实现？,无菌操作技术建立的理论依据和过程,路易斯巴斯德（Louis Pasteur,1822-1895）,曲颈瓶实验否认“自然发生学说

30、”建立“种胚学说”,曲颈瓶试验过程,约瑟夫李斯特（Joseph Lister 18271912）,发明和推广外科防腐技术的外科专家。认真仔细洗手；使用的手术器材和敷料做彻底的卫生处理（高温消毒）；向手术室空中喷洒石炭酸（空气消毒）；病人的伤口要消毒，要包扎绷带；医生要穿洁白的衣服。使用手术后死亡率由45 减少至 15（1889年）。,十九世纪外科手术的场景,现今无菌操作技术的介绍,世界各国洁净度等级对照表,生物安全实验室分级,中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准,设备及设施介绍,具有高效过滤器（HEPA）过滤器级别：HEPA过滤器（标准）；ULPA过滤器达到的洁净等级 HEPA：ISO 5

31、级（美联邦209E标准100级）；ULPA：ISO 4级（美联邦209E标准10级）过滤效率 HEPA：99.999%（0.3 m）；ULPA：99.9999%（0.12m）,水平流和垂直流超净工作台,WD-9409型 桌面式洁净工作台,生物安全柜,生物安全柜的要求（A2）,针对垂直下降型层流风向方式；气幕隔离式设计，防止内外交叉污染，提供对产品及操作者、环境的双重保护功能；有专门的空气处理系统（无害化处理外排）。,生物安全柜和生物安全实验室,风淋门,洁净手术室,吹淋 洁净传递窗,洁净病房,无菌操作规范（11步）,1.打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒半小时以上。2.进入净化室前先关闭紫外灯

32、，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。3.穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。4.风淋2分钟。5.0.1%过氧乙酸水（新洁尔灭）泡手，擦干。6.点燃酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。,无菌操作规范,7.打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。8.垂直式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。9.同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系或微生物菌种；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。10.漏在培养瓶上或台上的液体，立即

33、用酒精棉球擦净。11.操作完毕后恢复工作台面，并进行必要消毒灭菌。,中华人民共和国国家标准洁净厂房设计规范,总体设计（洁净厂房位置选择和总平面布置、工艺布置和设计综合协调、噪声控制、振动控制）建筑（人员净化和物料净化设施、防火和疏散、室内装修、装配式洁净室等）空气净化（洁净室正压控制、气流组组织和送风量、空气净化处理、采暖通风、风管和附件）给排水工业气体管道,制药企业洁净车间过道、车间内部和设备,无菌操作技术的介绍及演示（实验室）,操作要点：利用酒精灯或煤气灯的火焰外焰的外部高温区造成的无菌小环境来进行操作；形成上升气流，防止灰尘沉降污染；加热固定器皿口处的灰尘和微生物颗粒。还可以利用一些辅助

34、仪器设备进行操作（超净工作台，一般为100级）；无菌操作只是相对而言的，只要有人活动的地方就很难达到绝对无菌。操作规范、准确、迅速,分离、纯化的概念,分离指为了生产和科学研究的需要从自然混杂状态得到纯种的过程（可能达不到细胞纯）；纯化同一个菌落不一定是同种菌，需要对其进行纯化，使之达到细胞纯；多数情况下，二者无明显划分，是统一在一起的过程。,发明培养基，并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立；证实炭疽病因 炭疽杆菌；发现结核病原菌结核杆菌；科赫法则（4点）,罗伯特科赫（Robert Koch，1843-1910）,实验原理,分离的目的：得到单细胞得到单细胞的手段：利用显微单细胞挑取器操作（仪器

35、特殊，针对微生物效率不高）；稀释取样单位体积由多至少单位面积由多至少（单菌落分散好）。操作流程图：稀释单细胞培养形成菌落挑取单菌落多次重复达到纯化的目的,单细胞挑取法 简易单细胞挑取法 micromani pulator,实验方法和步骤,稀释涂布平板法平板划线分离法稀释混合平板法,稀释涂布平板法,倒平板倒置空白培养24小时（?）制备土壤稀释液涂布倒置培养挑取单菌落。不经特殊处理，只适用于好氧菌的培养。,稀释混合平板法,取已灭菌的空白培养皿加入分离样品稀释液（一般为1ml）倒入冷却至4550灭菌固体培养基旋转混合均匀（操作速度要快？）凝固后适温培养；挑取单菌落较困难（破坏培养基），菌落形态不易观

36、察（飞碟形），一般用于计数（分布均匀，相对误差较小？）和厌氧菌的分离培养。,平板划线分离法,利用接种环在固体琼脂培养基上划线，使粘在接种环上的微生物分布在所划线上而得到稀释（由点变线，线由点组成），达到分离的目的。操作简单，但不能进行定量测定；一般不用于分离的最初步骤，而多用于微生物菌种的后序纯化步骤。,稀释度和每皿中微生物个数关系示意图,厌氧培养的一些设备和方法,平板涂布培养分离法和平板混菌培养分离法,几种常微生物分离纯化方法的比较,以下为本次实验要完成的任务,1、培养基融化，倒平板和制备斜面,牛肉膏蛋白胨培养基：冷却至60左右，倒平板。马丁氏培养基：冷却至60左右，加入链霉素至终浓度30g

37、/ml，混匀后倒平板。高氏1号培养基：冷却至60左右，加入3%K2Cr2O7 1ml/500ml，混匀后倒平板。,每组倒1317个平板（根据各班次组数具体安排）；装若干支斜面试管（灭菌后摆放斜面），每种培养基统一制作（牛肉膏100支、马丁氏30支、高氏1号45支）。和其它组交换8个平板（自已组没有的2种培养基平板，各4个），用于稀释涂布平板法操作（共计12个）；平板划线分离法操作用牛肉膏蛋白胨培养基平板进行（2个，练习用）；斜面下次实验使用。,平板的制备（操作要快）演示,使灭菌的固体培养基冷却至60左右（容器外表面热而不烫），防止倒平板时过多冷凝水的产生；准备好若干灭好菌的培养皿，拆去包装，堆

38、放整齐备用；一只手拿好装有培养基的三角瓶，除去瓶口的包装放好（内部不能向上），瓶口倾斜放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤）。另一只手取1个灭菌的培养皿，抬平，放于酒精灯外焰外部（不可直接烧烤），打开培养皿盖（不可全开）；将培养基倒入已打开的培养皿内，使之刚好流平（1520ml），放置于水平的桌面上待凝固后即可（凝固过程请勿再动培养皿，否则会造成平板培养基表面不水平）。,将上述平板放入28恒温培养箱中倒置空白培养24小时以上，以检查灭菌是否彻底。同时还可以去除培养基表面多余的冷凝水水膜（24小时左右）。,平板及斜面无菌检查,制备平板的数量根据实验组确定,牛肉膏蛋白胨培养基平板（6个实验组准备组+2

39、个）=X个/组；高氏1号培养基平板（4个实验组准备组+2个）=Y个/组；马丁氏培养基平板（4个实验组准备组+2个）=Z个/组。,平板上的标注要求（一般要求在培养皿底部标注）,注意所有标注都可以用缩写或简写，目的只有一个，自已可以分清即可；标注的内容是根据自己的实验所决定的，没有完全的模式。,斜面的制备,将固体培养基中加入的琼脂通过加热（90以上）完全溶解；利用分装器将溶化的固体培养基加入到15150mm试管中（最常用，也可根据实际情况选用其它规格），加入量为试管高度的1/41/5；加塞、包扎、标记、灭菌；摆放、冷却、无菌检查；流程图：称量融化调pH 值过滤分装加塞包扎灭菌搁置斜面无菌检查使用或

40、备用,斜面制备的数量,牛肉膏蛋白胨培养基斜面100支/全班；高氏1号培养基平板45支/全班；马丁氏培养基平板30支/全班。,2、稀释涂布平板法,土壤悬液的制备及稀释，样品稀释液的加入（0.1或0.2ml/皿），涂布平板（3种培养基平板）稀释操作要点：一般采用10倍稀释法进行；每个稀释度的样品液必须充分振荡混匀；每1支所用到的无菌吸管只能接触一个稀释度，否则将造成较大的误差；涂布操作要点：涂布时，不在涂布器上过多加力（利用涂布器的自身重力，手只需带动其运动就可以了），以免划破培养基；以画同心圆方式涂布完成；涂布完成后正面放置30分钟以上再倒置放入温箱中培养。,稀释涂布平板法完成的工作内容,牛肉膏

41、蛋白胨培养基：涂布10-4、10-5各2皿高氏1号培养基：涂布10-3、10-4各2皿马丁氏培养基：涂布10-2、10-3各2皿,土壤悬液的制备,称取10g土壤（1g）加入到90ml（99ml）无菌水中放入摇瓶机中（100rpm）振摇20分钟取出后静止5分钟左右（使土壤颗粒沉降，以免阻塞吸管）吸取上层较清的液体制备相应的土壤稀释液注意：此操作不仅只适合于土壤悬液的制备，样品的来源可以是其它固体样品（食品、药品等）；根据样品的实际情况，可以采用不同的用量，自行设计。,从土壤分离微生物操作过程,安全吸（移）液器,微量移液器,倒平板（已介绍）制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90ml无菌水的、具

42、有玻珠的250ml三角瓶中，充分振摇20min，使微生物分散（10-1）。用一支1ml的无菌吸管取1ml的土壤悬液放入到一支盛9ml无菌水的大试管中，充分摇匀，然后用一支1ml的无菌吸管从此管中吸取1ml土壤悬液放入到另一支盛9ml无菌水的大试管中，混合摇匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液（根据实际掌握稀释度）。,涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-2、10-3、10-4和10-5四种稀释度（根据实际选择稀释度），然后用无菌吸管分别由10-2、10-3、10-4和10-5四管土壤稀释液中各取0.1ml或0.2ml对号放入已写好稀释

43、度的平板中，用无菌不锈钢涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀（以同心圆形式涂布），室温下静置30min左右，使菌液吸附于培养基上。,培养 将高氏号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28培养箱中培养35天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37培养箱中培养23天（如时间不好安排可以在室温下进行培养，一周后也就是下次课来进行下面的实验）。,因培养皿的需要量和占用较多，学生实验难以满足以下要求；所以在以后科研、工作中，做稀释分离和平板菌落计数时，至少要做3个稀释度，每个稀释度至少重复3个培养皿。,注意：,3、平板划线分离练习（2个平板）及操作要点演示操作,无菌操作；一般采用高浓度菌液，或直接挑取菌落或菌苔；接种环（

44、平整）和培养基接触的夹角越小越好；操作时动作要轻柔自然，不要过多的在接种环上加力；划完一组线后，接种环上的残留物要通过灼烧灭菌再进行下一组划线。,常见划线分离操作示意图,划线分离实际操作及效果,4、实验完成后用具的清洗,不锈钢刮子的清洗 用自来水冲洗干净，放置于桌面上。1ml吸管的清洗 取出塞入的棉花，用自来水冲洗干净；倒置于试管架上。18180ml大试管的清洗 用试管刷蘸洗衣粉水刷洗试管内外（除去记号笔的标记），自来水漂洗干净，倒置于试管架上。回收90ml无菌水瓶中的玻璃珠（倒入指定位置），清洗干净三角瓶（包括三角瓶上的标记）把包扎用的绳子和布理整齐放入抽屉中，包扎用的报纸放入垃圾桶中将实验桌打扫干净，实验用具摆放整齐，实验凳归位。,5、思考题：,如何从土壤中分离纯化得到自生固氮菌？要求：从培养基配方设计说明、分离纯化的实验操作步骤、用到的实验器材、检测确认方法等几方面设计实验，得到目的菌株。,下次实验内容,微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏介绍要点：区分四种微生物类群的一般菌落特征平板菌落计数的原理、计数原则及方法从平板上挑单菌落于斜面培养菌种保藏的原理、措施及方法,一个食用菌栽培工厂的接种间,