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1、第八章：几种重要病毒的简介,第一节 类病毒腺病毒第二节 类病毒细小病毒第三节 类病毒呼肠孤病毒第四节 类病毒冠状病毒第五节 类病毒流感病毒第六节 类病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）第七节 类病毒乙型肝炎病毒（HBV）第八节 人类杀手病毒的特征,本章重点,1.腺病毒复制的特点以及逃避宿主免疫监控的机制2.何为自主型和缺陷型细小病毒3.轮状病毒基因组结构特点、编码蛋白的功能及逃避宿主免疫监控的机制4.流感病毒的变异特点5.SARS的起源流6.艾滋病毒的致病特点7.乙肝病毒复制的特点,第一节 类病毒腺病毒,腺病毒（Adenovirus）最初于1953年从人的增殖腺分离出来，它是一群分布十分广泛的DNA
2、病毒。能引起人类呼吸道、胃肠道、泌尿系统及眼的疾病，少数对动物有致癌作用。腺病毒科（Adenoviridae）病毒分四个属：哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）禽腺病毒属（Aviadenovirus）富AT腺病毒属（Atadenovirus）唾液酸酶病毒属（Siadenovirus）,一、生物学性状,腺病毒无囊膜，直径80110nm，呈二十面体对称，线状的双股DNA与核心蛋白形成直径6065nm的髓芯，被包裹于衣壳内。衣壳由252个直径810nm的壳粒组成，壳粒排列在三角形的面上，每边6个，其中240个为六邻体(Hexon)，另12个为五邻体基底(Penton，顶点壳粒)。每个五邻
3、体基底上结合着1根(哺乳动物腺病毒)或2根(禽腺病毒)长977.5nm的纤维突起，这些纤维以五邻体蛋白为基底由衣壳面伸出，纤维顶端形成头节区。,衣壳蛋白解离后，具有三种抗原。其中组成六邻体的衣壳蛋白具有组特异性抗原；组成五邻体的基底具有同组共有的抗原；而组成五邻体的纤维是型特异性抗原所在。自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群。,腺病毒耐酸，故能通过胃肠道而继续保持活性，这为口服腺病毒载体的研制提供了方便，许多腺病毒就是从人和动物的粪便中获得的。无囊膜，对有机溶剂不敏感，但在丙酮中不稳定。腺病毒在-20
4、时可长期存活，56加热可灭活。适宜pH为56，pH值在2以下或10以上均不稳定。,二、病毒的复制,1、基因组的结构特点：反向末端重复序列（inverted terminal repeat,ITR）：每股核酸末端都有长约100bp的反向末端重复序列，是复制的起始位点。末端蛋白（TP）：每股DNA的5端通过脱氧胞苷共价结合一个小蛋白质（55ku）即末端蛋白（TP）。对DNA复制的起始非常重要。蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在DNA周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在左端ITR的3侧有一段长约300bp的包装信号
5、（）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。,ITR,ITR,E1A E1B,L1 L2 L3 L4 E3 L5,E2B E2A E4,2、病毒的复制,粘附和进入细胞 腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。因为人腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。,转录与复制腺病毒基因早期产物的主要功能：E1区基因表达产物（调控宿主细胞，与病毒致癌相关）E1区基因进一步分为E1A和E1B：E1A蛋白的主要功能是调节细胞代谢，将感染细胞带入DNA复制周期，细胞开始储存病毒D
6、NA复制所需的原料。E1A蛋白还可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的启动子，也可以拮抗干扰素的作用。,E1B蛋白的主要功能是防止细胞凋亡，调控晚期基因的表达。19K与细胞Bcl-2基因（抑制细胞凋亡）的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。E1B 55K基因产物可以下调p53基因（刺激细胞凋亡）的转录水平，当然这种调节功能不是绝对的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也参与了这一过程。另外，E1B 55K基因产物干扰细胞mRNA从细胞核释放。,E2区基因表达产物（复制相关蛋白）可分为E2A和E2B。其中E2A即单链DNA结合蛋白（s
7、sDBP,single-stranded DNA binding proteins）；E2B主要产物有两种，分别是末端蛋白前体（pTP,precursor terminal protein）和病毒DNA聚合酶（pol）。三种蛋白与至少三种细胞内的因子相互作用，启动腺病毒DNA复制以及病毒晚期基因的转录和翻译过程。,E3区基因表达产物（逃避免疫攻击）主要功能是破坏宿主的免疫防御机制，而与病毒基因组的复制无关。E3基因的产物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒而被称为腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19K蛋白可以在内质网
8、上与MHC-I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓MHC-I的表达。RID（receptor internalization and degradation）&以及14.7Kd蛋白可以抑制由TNF（肿瘤坏死因子）诱发的细胞凋亡，促进Fas（凋亡通道中的一种死亡受体）降解，下调TNF受体水平。,E4区基因表达产物 E4区的基因产物通常被称为orf 16/7，主要与病毒信使RNA的代谢有关，还有促进病毒DNA复制以及关闭宿主蛋白合成的功能。研究发现，一些E4产物可以诱导一些蛋白酶活性，降解宿主的某些DNA修饰酶，防止病毒DNA发生串联。E4 orf3 VA RNA是一些由腺病毒转录的
9、非翻译RNA，为“诱捕”RNA分子，结合PKR（宿主蛋白激酶），使该蛋白失活，关闭干扰素的产生。,一般而言，DNA的复制是由RNA启动的，而在腺病毒却是所谓的蛋白启动。不存在冈崎片段，其DNA复制可以从任何一端开始，甚至两端同时进行。,复制过程中形成ssDNA的中间形式。,5,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,3,5,装配与释放 病毒基因组复制通常在感染后数小时开始表达。同时早期基因的转录和翻译被关闭，晚期基因开始表达。大部分的晚期基因的转录是以一个共同的主要晚期启动子（MLP,Major Late Promoter）调控的。实际上MLP的活性与病毒基因组复制密切相关，有研究表明一旦
10、腺病毒基因组开始复制，MLP的活性将明显增强。晚期基因主要编码腺病毒的结构蛋白。病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒。病毒水解细胞骨架蛋白K18，使之不能聚合形成中间丝结构，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。,三、对宿主的防卫逃逸,从病毒入侵到释放出新病毒需要2天，较慢，容易受到宿主免疫攻击。腺病毒1/4基因用于对付宿主免疫系统。1、防止细胞凋亡：E1B19K与细胞Bcl-2基因（抑制细胞凋亡）的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。E1B 55K基因产物可以下调p53基因（刺激细胞凋亡）的
11、转录水平。2、加速病毒释放：E3基因的产物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒而被称为腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。,3、破坏干扰素系统：没有囊膜，不刺激干扰素产生；E4 orf3 VA RNA是一些由腺病毒转录的非翻译RNA，为“诱捕”RNA分子，结合PKR（宿主蛋白激酶），使该蛋白失活，关闭干扰素的产生。（病毒利用DNA基因组的双链进行mRNA转录，会出现dsRNA）4、躲避杀伤性T细胞：E3-19K蛋白可以在内质网上与MHC-I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓MHC-I的表达。,5、躲避天然杀伤细
12、胞：E3基因编码的RID蛋白结合腺病毒感染细胞的死亡受体（Fas），将其从细胞表面移走，并监督其被破坏。作为弥补，E3-14.7K蛋白可以干扰来自死亡受体的信号以防RID蛋白出现遗漏。天然杀伤细胞和杀伤性T细胞都有两种方式杀伤细胞：通过其表面的蛋白插入靶细胞表面的死亡受体，诱导细胞凋亡，杀死靶细胞；将颗粒酶注入靶细胞（还没有任何病毒进化出对付颗粒酶的方法）6、利用自己的DNA聚合酶，腺病毒可以产生抗原漂变。,四、致病性与免疫性 人腺病毒经呼吸道和粪口途径传播，也可通过呼吸道或污染物品传播。病毒在咽、结膜尤其是小肠上皮细胞内增殖，偶尔波及其他脏器，隐性感染常见。疾病一般为自限性，感染后可获得长期
13、持续的型特异性免疫力，中和抗体损伤作用重要。,在病毒性疾病中，有些为自限性感染，即感染后病程较短，随体内病毒被迅速清除而痊愈。如甲型肝炎、戊型肝炎、流行性感冒、流行性腮腺炎、病毒性胃肠炎等等。有些则为慢性感染，感染后病程长，病毒能在体内较长期存在，病情呈慢性进行性发展，如慢性乙型肝炎，艾滋病等。病毒性疾病的病症与病毒的侵入途径密切相关；而与病毒有无包膜及病毒结构无明显关系。由口咽途径侵入的病毒无论属RNA或DNA还是有无包膜，大多为自限性疾病；经体液和血液传播的人类病毒性疾病，易形成持续感染。即使同种病毒由于侵入途径不同，其病毒感染状态也不相同。,五、微生物学检查 1、病毒分离 自急性期病人咽
14、、直肠、结膜等处采取标本，迅速接种敏感细胞，根据特征性细胞突变及抗原性鉴定病毒。2、血清学检查 取急性期和恢复期血清进行补体结合试验，抗体升高4倍或以上，可判断为近期感染。六、防治原则 因存在许多健康带毒者，隔离病人对防止腺病毒传播几乎无效。疫苗要保证无致癌危险。因此，研制高纯度的亚单位疫苗是今后的主要任务。,第二节 类病毒细小病毒,细小病毒科(Parvoviridae)是迄今所知道的最小的一类动物病毒，只发现其中少数病毒能导致有明显临床症状的传染病，而大多数呈潜伏或持续感染状态。该科含有两个亚科：细小病毒亚科（Parvovirinae）和浓病毒亚科（Densovirinae）。其中浓病毒亚科
15、的寄主仅限于无脊椎动物。,一、生物学性状 细小病毒粒子为立体对称的二十面体，有三种衣壳蛋白，无包膜，直径18-25nm。其线状ssDNA约占整个病毒粒子重量的2534，分子量为1.41061.7106，沉淀系数为2327s。细小病毒对外界理化因素的抵抗力非常强，在pH3和pH9、56处理60min仍保持稳定，却能被甲醛、羟胺和一些氧化剂所钝化。细小病毒几乎都有凝集红细胞的特性，血凝和血凝抑制试验是鉴定本病毒和诊断本病的方法。,这类病毒的核酸由于在病毒包装时包装了双链中的一条，因此，不同病毒粒子中的ssDNA极性可能不同。总的来说，自主型的病毒中，其核酸倾向于一种类型，即与mRNA互补的一类；而
16、依赖型的病毒中，两种极性的核酸各占一定的比例。,二、病毒的复制 这类病毒的核酸分子小，信息量极少，复制时不得不依赖于细胞或“辅助病毒”的帮助。据此可将细小病毒分为两类：自主型（autonomous）缺陷型（defective）,自主型：这类病毒只有当寄主细胞处于核酸合成期（S期）才能复制，因为此时细胞内存在有许多细胞分裂所需的酶可被病毒利用，病毒本身仅仅提供一个模板核酸。这类病毒独立地侵入寄主细胞，不需要辅助病毒，仅凭寄主细胞的酶即可以复制，故称之为自主型。,缺陷型：依赖性病毒属属于此类。这类病毒侵入寄主细胞后，即使寄主细胞处于S期也不能复制，因为它们缺少某种特异的酶，必须依靠另一种病毒，即辅
17、助病毒（如腺病毒）来提供，因而成为缺陷型。,现以小鼠细小病毒（Mice minute virus,MMV）代表自主型，腺联病毒2型（Adeno-associated virus type2,AAV2）代表缺陷型分述其复制过程。1、基因组的结构特点 MMV核酸为5084bp，AAV2核酸为4679bp，在所有细小病毒ssDNA的3端或5端都有多余100bp甚至300bp的核酸回文序列（palindromic），这些片段可以回折，与自身互补序列形成发夹结构。MMV的5端和3端序列差异较大，而AAV2的5端和3端序列相互反向重复，可形成锅柄样结构。MMV与AAV2都有两个较大的阅读框（ORF），每个
18、ORF约占基因组的一半。左侧ORF涉及调节功能，右侧ORF涉及编码结构蛋白。,2、病毒的复制 MMV基因组都含有两个大的ORF:第一个从mp6-mp42（基因图谱位置，map position,mp），为repORF，编码两个非结构蛋白NS1和NS2。第二个从mp45-mp90，为capORF，编码外壳蛋白。MMV两个ORF各有一个启动子，分别位于mp4和mp38，均含有TATA盒。在末端mp95-mp96位置为聚腺苷酸信号（AATAAA）。mp46-mp48是小的内含子，mp8-mp38为大的内含子。,图8-7 MMV基因组转录模式细线中的突出部分代表内含子,由P4启动子驱动的两个转录体分别
19、编码NS1和NS2，第三个转录体由P38启动编码外壳蛋白。其中NS1和NS2首先合成，它们调控其他基因的表达。这两种蛋白都是磷酸化的，NS1作为反式激活蛋白可激活P4和P38，其功能基团位于C端的129为氨基酸残基。有效的DNA复制和mRNA翻译都需要NS2的参与。capORF编码外壳蛋白Vp1和Vp2，蛋白酶降解Vp2产生主要外壳蛋白Vp3。,AAV2基因组也含有两个大的阅读框，有三个启动子，分别位于mp5、mp19和mp40。转录出3个转录体，进一步剪切，编码4种非结构蛋白和三种外壳蛋白。其中rep78和rep68为位点特异的核酸内切酶，参与病毒基因组的复制及病毒基因组插入寄主细胞基因组的
20、过程。rep52和rep40并非病毒基因组复制所必须，它们主要介导病毒颗粒的组装。,图8-8 AAV2基因组转录模式 细线中的突出部分代表内含子,AAV2在寄主细胞内复制需要一些不相关的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒等。以腺病毒为例，发现起辅助作用的腺病毒的早期功能蛋白。腺病毒蛋白E1A对AAV2基因表达起反式活化作用；35KDa的E4协同55KDa的E1B参与调控AAV2转录体的运输，E1B在AAV2DNA复制时也起重要作用；72KDa的E2A是ssDNA结合蛋白，可刺激AAV2启动子的转录及转录本向细胞质转运。,MMV和AAV2均在寄主细胞核内复制，并在细胞核内组装成病毒粒子。两者复制过程基
21、本类似，DNA复制时均不需要RNA引物，也不环化，由于3端形成的发夹结构，产生了对DNA多聚酶作用必须的引物OH。由于病毒基因组是单链，复制过程中存在RF。AAV2复制过程如下：其3端ITR形成发夹结构为DNA的复制提供起始引物，复制沿着亲本链一直延伸到5端，完全复制亲本链需要产生一个新的3OH，此时病毒编码的点位点特异的核酸内切酶Rep78和Rep68在箭头所示处，即末端分解位（terminal resolution site）切开亲本链，由此处继续延伸，合成复制中间体。此时亲本链的 3端为新合成的链，这样亲本链的ITR与开始不同，但互补。新合成的3端又可以形成发夹结构引导新一轮的DNA 复
22、制，这样可以产生一个新的基因组DNA和一个没有复制完的含双链信息的DNA，再经过位点特异的核酸内切酶作用，可继续复制。,三、AAV的潜伏感染 在没有辅助病毒共同侵染的条件下，AAV DNA可以整合到寄主细胞染色体中，建立潜伏感染，以后又可被辅助病毒的侵染所活化，进入复制循环。AAV的潜伏感染相当普遍，在20%的非洲绿猴肾和1%-2%的人胚胎细胞中可检测到。AAV2的ssDNA进入寄主细胞后，必须复制成双链形式才可以整合至染色体。这需要P5启动子启动少量的基因转录，产生rep78和rep68，它们一方面参与基因整合，另一方面也抑制了AAV2三个启动子的转录。尽管整合没有严格的特异性，但70%-1
23、00%的整合都发生在人染色体19q13.3-qter，且一般是几个病毒基因组首尾相连。,第三节 类病毒呼肠孤病毒,呼肠孤病毒科，Reoviridae的命名，是由respiratory enteric orphan virus各取其第一个字母而来。20世纪60年代初，曾从人和动物的呼吸道或肠道中分离出这类病毒，当时对它的致病作用不清楚，所以称它为呼吸道(R)、肠道(E)，孤儿(O)病毒，简称呼肠孤病毒。现在这一命名已失去其本来涵义，因为后来发现有些病毒虽与它有共同的基本特点，但与呼吸道或肠道无关。本科病毒分布极广，包括能感染人、脊椎动物、昆虫、植物、真菌的12个属。其中能使人、畜致病的主要成员有
24、：轮状病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、羊蓝舌病病毒、非洲马瘟病病毒等。,一、生物学性状 本科病毒的病毒粒呈球形，大小在6080nm之间，根据形态学分析它是一个二十面体的结构，有多层衣壳，如人轮状病毒有三层，都没有囊膜。氯化铯中浮力密度为1.311.38g/mL；具有线性分节段的双链RNA基因组，可分为10条、11条和12条，因属而异。dsRNA的正链5端有“帽子”结构，负链5端为磷酸化结构，其3均没有polyA结构。病毒中含有依赖于RNA的多聚酶。,利用血清学方法，轮状病毒被分为7个不同的组A-G（Vp6），A、B、C三组常见于人和动物，引起婴幼儿腹泻的为A组，感染青壮年的为B组，散发病例为C组，
25、其中B组仅在中国引起爆发流行。D、E、F、G目前仅见于动物。每组内又有不同的血清型，针对外壳蛋白Vp7已鉴定出至少14种Vp7血清型。在同一组中，可发生基因重配，不同组之间不可能发生。轮状病毒对理化因子的作用有较强的抵抗力。病毒经乙醚、氯仿、反复冻融、超声、371小时或室温（25）24小时等处理，仍具有感染性。该病毒耐酸、碱、在pH3.510.0之间都具有感染性。95%的乙醇是最有效的病毒灭活剂，56加热30分钟也可灭活病毒。,1、病毒颗粒 电镜下可见到三种类型的轮状病毒颗粒结构。第一类为有感染性，具三层衣壳的病毒颗粒，含衣壳蛋白Vp1、Vp2、Vp3、Vp4、Vp6和Vp7；第二类为没有外壳
26、的双层颗粒，直径70nm，无感染性，表面粗糙，不含Vp4和Vp7；第三类仅有内壳，直径50-50.5nm，无感染性，含有Vp1、Vp2和Vp3。完整的病毒颗粒直径约75nm，具有辐条状结构和一个非常清晰的平滑周边，酷似车轮，轮状病毒因此而得名。Vp7是三聚体，构成毒粒的外衣壳。Vp4是二聚体，形成长20nm、末端为叉状嘴唇形的突起，从中衣壳通过外衣壳的孔洞伸出粒子表面。Vp6三聚体构成中衣壳，又与构成内衣壳的Vp2相互作用。,核心中含有11条dsRNA，按分子量从大到小进行排列，分别编码12种蛋白质，6种结构蛋白和6种非结构蛋白。去除蛋白质的dsRNA无侵染性，在5端和3端都有一段非翻译区，两
27、端都有呼肠孤病毒科病毒特有的保守序列。,2、病毒编码蛋白质的特性及其功能,Vp4-第四条dsRNA编码，组成外衣壳蛋白，非糖基化。其主要功能有：有凝集素活性；与寄主细胞受体结合；可裂解为分子量分别为60KDa的Vp5和28KDa 的Vp8，强化病毒的侵染力；可诱导体内中和抗体；在小鼠和小猪体内，Vp4是病毒毒力的决定簇。动物轮状病毒的Vp4有776个氨基酸组成，而人类的为775个。建立了依赖Vp4的病毒血清型（P血清型），其型特异性位点位于第84-180位氨基酸之间。,Vp6主要结构蛋白之一，组成中衣壳，占病毒颗粒的51%，由第六条dsRNA编码。可同时与外衣壳的Vp7、Vp4和内衣壳的Vp2
28、相互作用，因此，对维持颗粒形态起重要作用。Vp6为三聚体，非常稳定，且大多数的轮状病毒株系的Vp6有保守的抗原决定簇，是检测的主要靶抗原。Vp6与病毒内依赖RNA的聚合酶活性相关，但本身并不具备酶活性，除去Vp6则聚合酶失活。Vp6为疏水蛋白，有高度的免疫原性，但并不知道它是否象Vp4那样可诱导体内的保护免疫反应。Vp6含有一个共同的（交叉反应性的）表位，称为组抗原（A-G），定位于第48-75位氨基酸之间。,Vp7外衣壳的主要构成蛋白，占病毒颗粒的30%，富含N-连接甘露寡糖的糖蛋白，由第九条dsRNA编码。Vp7有326个氨基酸，N端有可裂解的信号序列。正是这个信号序列引导Vp7插入细胞内
29、质网膜。裂解点在N端第51位的Gln(谷氨酸)。插入内质网膜靠两个疏水序列，分别位于51-61和61-110的氨基酸。Vp7一旦插入内质网膜，既被保护不受内切酶降解，Vp7(glycoprotein)也是重要的中和作用抗原，并依此决定病毒的血清型（G1-G14血清型）。,NSP4成熟的、带寡糖的糖基化的NSP4分子量为28KDa，N-连接甘露寡糖，第十条dsRNA编码。在N端有三个疏水功能域，可以穿过内质网膜，N端保留在膜内，而亲水的C端伸到细胞质中，是与亚病毒颗粒（Vp6）结合的受体，从而使亚病毒颗粒在装配过程中能通过芽生进入内质网膜，NSP4的受体结合位点在161-175位氨基酸之间。NS
30、P4蛋白是一个十分保守的蛋白，比较不同来源轮状病毒毒株的NSP4，发现它们的同源性在87.3%-96.6%。,二、病毒的复制 有关轮状病毒复制的研究主要在猴肾传代细胞中进行，病毒的复制过程全部在包浆内进行。病毒通过与细胞表面特异的受体结合（可能存在两种不同的受体），再以胞饮或直接的方式进入细胞，在溶酶体内完成外衣壳的降解，形成亚病毒颗粒，具有中层和内层，此时既开始转录。,在细胞质液体中解开dsRNA很困难，而亚病毒颗粒内并非液体，dsRNA很容易解开，转录的mRNA通过双层衣壳上的小孔进入细胞质。,病毒转录子的合成是在一种病毒携带的依赖RNA的RNA多聚酶催化下进行，转录为非对称，所有的转录子
31、都是从负链脱下的全长正链RNA。该正链RNA一方面作为蛋白翻译的模板，另一方面也是合成子代负链RNA的模板。负链RNA的合成也是在亚病毒颗粒中进行，细胞中没有游离的病毒dsRNA存在。这些亚病毒颗粒在细胞内或无细胞系统中均是双链RNA的合成产所，是由Vp1和 Vp2、以及少量的Vp6、大量的非结构蛋白NSP3和较小量的NSP1和NSP2等蛋白质组成的复制酶的复合物。,大部分的轮状病毒蛋白是在游离的核糖体上合成，而Vp7 和Vp4是在内质网上的核糖体合成，合成后嵌入内质网膜。轮状病毒形态发生过程中最显著的特征是在细胞浆病毒质中装配的亚病毒颗粒（含两层衣壳）向内质网膜芽生，在成熟过程中，病毒颗粒获
32、得一过性的包膜。当病毒向内质网内部移动时，轮状病毒失去这种一过性获得的包膜，取而代之的是一层薄的蛋白层，这层蛋白层最后组装成病毒颗粒的外衣壳，含Vp7 和Vp4。,三、对宿主防卫的逃逸1、这种“躲在衣壳中复制”的方法帮组轮状病毒逃避宿主细胞的干扰素防疫系统，为病毒的繁殖和传播赢得时间。2、轮状病毒复制快，“打了就跑”，在获得性免疫系统发挥作用前，大量病毒已通过粪便排除。3、轮状病毒感染后通常不会对后续感染产生完全的免疫力，免疫系统仅仅对轮状病毒“扫了一眼”。即便有记忆力，轮状病毒可通过无症状患者粪便排除，扩大感染。,四、致病性与免疫性 人类轮状病毒感染常见于6个月2岁的婴幼儿，主要在冬季流行，
33、一般通过粪-口途径传播。病毒侵犯小肠细胞的绒毛，潜伏期24天。病毒在胞浆内增殖，受损细胞可脱落至肠腔而释放大量病毒，并随粪便排出。病人最主要的症状是腹泻，其原因可能是病毒增殖影响了细胞的搬运功能，妨碍钠和葡萄糖的吸收，也可以是刺激了小肠内的肠道神经系统受体。严重时可导致脱水和电解质平衡紊乱，如不及时治疗，可能危及生命。感染后血液中很快出现特异性lgM、lgG抗体，肠道局部出现分泌型lgA，可中和病毒，对同型病毒感染有作用。一般病例病程35天，可完全恢复。隐性感染产生特异性抗体。,五、微生物学诊断 传统的方法是对腹泻粪便液直接作电镜或免疫电镜检查，但耗时较长，且由于设备上的限制，较难普遍应用。世
34、界卫生组织已将ELISA双抗体夹心法（检测病毒抗）列为诊断轮状病毒感染的标准方法，目前国内外均有相应试剂盒出售。此外核酸电泳和核酸杂交已渐成常规技术，在诊断、鉴别诊断及分子流行病学研究中发挥重要作用。,六、防治原则 重视饮用水卫生，并注意防止医源性传播，医院内应严格做好婴儿病区及产房的婴儿室消毒工作。目前尚无特异有效治疗药物，主要是补液，维持机体电解质平衡。国外曾有报道轮状病毒活疫苗可使儿童获得保护，国内活疫苗正在研制之中。,第四节 类病毒冠状病毒,冠状病毒科（Coronaviridae）包括：冠状病毒属（Coronavirus）和环形病毒属（Torovirus）。冠状病毒属依据其基因组和抗原
35、性的特点，分为三组：第1组和第2组为哺乳动物的病毒，第3组为鸟的病毒。冠状病毒科成员具有囊膜，大多数病毒的宿主范围较窄，只能感染一种或几种亲缘关系较近的动物细胞，冠状病毒的宿主范围与病毒特异的细胞受体有关。,SARS（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS）又称严重急性呼吸综合症，是一种新的威胁人类健康的呼吸系统烈性传染病，2002年11月在中国广东发现首例SARS病人，此后疫情蔓延30多个国家和地区，有8000多人感染，800多人死亡，引起全球关注。世界卫生组织(WHO)确认引起该病的是严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respira
36、tory syndrome coronavirus，SARSCoV，SCoV)，冠状病毒属的一个新成员，是第一个可以引起人类严重疾病的冠状病毒。,一、生物学性状 成熟的冠状病毒颗粒直径60-220nm不等，其形态学上最显著的 特征是病毒被膜处有明显的棒状膜外粒子，酷似中世纪欧洲帝王的王冠。病毒粒子中不包含RNA聚合酶，但存在少量蛋白激酶，这种蛋白激酶究竟是由病毒还是宿主编码，目前尚不清楚。,病毒有囊膜，膜上有三种结构糖蛋白：刺突蛋白S（spike glycoprotein）；膜蛋白M（membrane glyprotein）；小分子外膜蛋白E（small envelope glycoprote
37、in）。在部分病毒囊膜上还能找到血凝素酯酶HE（hemagglutinin acetylesterase glycoprotein）。,核酸为无节段（+）ssRNA，长约2731kb，在所有的RNA病毒中，冠状病毒的基因组最大。为多顺反子结构，其基因组5端有帽子结构，3端有poly(A)尾，可以作为翻译模板，具传染性。紧接帽子结构之后是60-80个碱基的先导RNA序列和200-500个碱基的非编码区。病毒基因组包含6-12个ORFs，在各个ORF之间有基因重叠区或基因间隔序列(intergenic sequence)。冠状病毒的复制酶（依赖RNA的RNA聚合酶，解旋酶，蛋白酶）由基因组5端的占
38、2/3-3/4的两个大阅读框（ORF1a和1b）（即基因1）编码。通过核糖体翻译移框的机制，产生两个多肽前体：pp1ab和pp1a。其它结构蛋白主要位于基因组3端。,在所有冠状病毒基因组中，聚合酶基因和3种结构蛋白基因的排列次序均相同，即5-Pol-S-M-N-3，其他非结构蛋白的排列次序依不同的冠状病毒种类而有明显的差异。,冠状病毒转录的亚基因组mRNA间具有套式（nested）的结构特征和一段共同的3端列。除最小的亚基因组mRNA外，其余mRNA均含有两部分内 容，即自身基因和3下游其它蛋白基因，但仅翻译自身蛋白基因。这些亚基因组mRNA的5端均带有一段来自于基因组5最前端的保守引导序列，
39、该引导序列对病毒基因的表达有很强的顺式作用。在SARS-CoV中，每个基因之间均有一段转录调控序列（TRS）：5-UCUAAAC-3。通过该段序列与转录酶和细胞因子的相互作用，将一段72nt的基因组5最前端的保守引导序列与每个ORF相连。,结构蛋白中，S蛋白为伸出被膜外的棒球形糖蛋白，在病毒表面以三聚体形式存在。其主要功能为：结合细胞受体；触发病毒被膜与细胞质膜或内吞体膜融合；可诱导细胞间的融合；诱发机体产生中和抗体。,M蛋白主要负责病毒颗粒的组装，功能为：决定病毒的形态发生；病毒装配时选择S蛋白；结合N（核衣壳磷蛋白）蛋白；病毒装配时专一地选择病毒基因组RNA。,E蛋白也是病毒表面的一种糖蛋
40、白，数量相对较少，它与M蛋白相互作用，决定病毒粒子的出芽位点。HE仅存在与少数冠状病毒表面，以二硫键连接的同源二聚体形式存在，可能与病毒引起的病理相关。N蛋白（核衣壳磷蛋白）位于囊膜内，与RNA结合形成核衣壳，其功能为：包裹基因组RNA形成螺旋对称的核衣壳；在装配过程中结合M蛋白；病毒mRNA翻译的增强子。,三种非结构蛋白为病毒复制所必需：1、依赖RNA的RNA聚合酶（RDRP）功能为：转录病毒负链基因组RNA；转录结构蛋白mRNA；复制病毒基因组RNA。2、解旋酶打开RNA的双螺旋。3、3CLpro蛋白酶负责上述两种酶的加工成熟。,SARS冠状病毒基因组全长29.7kb，有14个开放阅读框架
41、，缺乏HE蛋白。其基因组的2/3区域编码病毒复制相关酶（5端），1/3区域依次编码S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白等4个病毒结构蛋白（3端），及包含5-9个在已有蛋白数据序列库中找不到任何同源序列的未知蛋白的ORF。,SARS-CoV比其他冠状病毒更稳定。在室温下，可在粪便和尿液中稳定存在1-2天，在腹泻病人的大便中（pH较高）可存活4天以上。然而，56加热90min或75加热30min就能灭活SARS-CoV，应用含氯消毒剂和过氧乙酸，按卫生部推荐的浓度，在几分钟内完全可以杀灭粪便和尿液中的SARS-CoV，紫外线也可以杀灭SARS-CoV。,二、病毒的复制 冠状病毒的整个复制周期在寄主细胞质
42、中进行。入侵：首先病毒表面的S蛋白与寄主细胞表面专一的受体结合，然后通过两种途径进入细胞，一种是受体介导的内吞，另一种为病毒与寄主细胞的质膜融合。SARSCoV 的受体有两种，ACE2蛋白与血管紧张肽转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）同源，为SARS冠状病毒的受体。氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN)也是SARSCoV的受体之一。,冠状病毒成熟的颗粒中并不存在RNA病毒复制所必须的RNA聚合酶，因此，它进入寄主细胞以后，首先以病毒基因组RNA为模板，利用寄主细胞的蛋白质翻译系统，表达病毒RNA聚合酶。然后利用该酶，完成负链基因组RNA
43、的转录合成、各级结构蛋白mRNA的合成、以及病毒基因组RNA的复制。冠状病毒各个结构蛋白的成熟mRNA的合成，不存在转录后的修饰剪切过程，而是直接通过RNA聚合酶和一些转录因子，以一种“不连续转录”（discontinuous transcription）的机制，通过识别特定的转录调控序列（transcription regulating sequences,TRS），有选择性的从负义链RNA上，一次性转录得到构成一个成熟mRNA的全部组成部分。,冠状病毒的颗粒组装发生在内质网和高尔基体的区域。组装时，N蛋白包裹基因组RNA形成螺旋型的核衣壳，然后M蛋白通过与N蛋白的结合并识别基因组上的包装信
44、号序列启动病毒囊膜的组装，E蛋白和S蛋白则通过与M蛋白的相互作用整合入病毒颗粒。在高尔基体内加工形成包内体样结构，以胞吐方式释放到细胞外，感染新的寄主。,冠状病毒的复制和成熟,三、SARS-CoV致病性与免疫性 SARS-CoV可感染多个组织器官，包括：肺、脾、肠道、气管、淋巴结、肾等，特别是肺部，并造成损伤。引发肺部损伤机制为过强的自身免疫反应，大规模免疫细胞的激活，会破坏正常的细胞和组织。SARS患者出现发烧、咳嗽及快速进展的呼吸系统衰竭，同时伴随寒颤、肌肉疼痛、淋巴细胞减少等症状，严重时，患者死亡。同时，患者体内产生SARS-CoV专一性的抗体，一般7天后出现IgM，10天达到高峰，15
45、天左右下降；IgG在10天后产生，20天左右达到高峰。SARS-CoV的潜伏期平均为6.4天。SARS-CoV主要以近距离飞沫传播为主，同时可通过手接触呼吸道分泌物经口、鼻、眼传播。也可能存在粪口传播等其它传播途径的可能性。该病毒对温度很敏感，在33时生长良好，但35就使之受到抑制。由于这个特性，冬季和早春是该病毒疾病的流行季节。,四、微生物学诊断 目前SARS-CoV的诊断方法主要有4类：临床表现及排除性诊断、影像学诊断、血清学抗体诊断和病毒学诊断。ELISA诊断中，主要应用针对SARS-CoV 结构蛋白的特异性多抗或单抗，特别是针对S蛋白的特异性抗体，在发病早期进行诊断。通过电镜观察和RT
46、-PCR技术也能对病毒进行鉴定。,五、防治原则 病毒对热敏感，紫外线、来苏水及0.1%过氧乙酸等都可在短时间内将病毒杀死。目前，冠状病毒的血清型和抗原变异性还不明确。冠状病毒可以发生重复感染，表明其存在有多种血清型（至少有4种已知）并有抗原的变异，其免疫较困难，目前尚无特异的预防和治疗药物。可以通过非特异性预防措施（即预防春季呼吸道传染疾病的措施，如保暖、洗手、通风、勿过度疲劳及勿接触病人，少去人多的公共场所，及时隔离病人等）进行预防。,六、细胞培养及动物模型 病毒分离是诊断病毒感染的重要方法。可以通过细胞培养对来自SARS病例样本(如呼吸道分泌物、血液或粪便)中的病毒进行分离。与其它冠状病毒
47、相比，SARS-CoV的分离相对容易。目前发现，SARS-CoV可在非洲绿猴肾传代细胞(VeroE6)、人宫颈癌传代细胞(Hela)、狗肾传代细胞(MDCK)、肿瘤横纹肌传代细胞(RD)、人胚肺传代细胞(2BS)、人胚肾传代细胞(HEK293)等多种组织细胞中增殖并引起细胞病变，但以VeroE6细胞最为敏感。细胞培养阳性结果是人体内存在SARS-CoV的可靠证据，说明患者现在或最近受到SARS-CoV的感染。,目前SARS的研究主要集中在致病机制、抗SARS疫苗和药物的制备方面，这些研究的基础有赖于SARS动物模型的发展，SARS动物模型应该符合以下标准：被SARS-CoV感染的动物表现出类似
48、SARS患者的症状和体征;从实验感染的动物体内可分离到病毒；动物体内存在针对病毒感染的特异的免疫反应；活检和尸检显示出动物具有SARS患者一样的病理特征。至今，SARS动物模型包括非人灵长类、雪貂、猫、鼠等，然而这些动物很少能够模拟出可靠的SARS患者的呼吸症状。他们大多数只符合上述一部分条件。,七、SARS-CoV的疫苗研制,1、正在研制的疫苗：治疗性疫苗（抗体）灭活病毒疫苗病毒样颗粒（VLP）疫苗核酸疫苗（基于S蛋白和N蛋白）多表位疫苗2、存在问题：RNA病毒多变对疫苗研发的挑战 动物模型问题,抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement,ADE）的问题
49、 一般来说，机体产生的病毒抗体或者对病毒有中和或抵抗作用，或者是一些无中和作用的抗体，但近年来相继在人免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒（IV）、猫感染性腹膜炎病毒（FIPV）、登革病毒（DV）等病毒中发现了一种现象，这些病毒的抗体滴度在低水平或高水平时对病毒存在中和作用，而在中度水平或亚中和滴度水平时（称为感染增强抗体）与病毒形成病毒-抗体复合物，能明显增强Fc受体（FcR）或补体受体（CR）阳性细胞对该种病毒感染，从而引起疾病，这种现象称为抗体依赖的病毒感染增强作用（ADE）。其中猫感染性腹膜炎病毒（FIPV）为猫冠状病毒，推测SARS-CoV疫苗可能存在ADE现象，所以在未阐明SARS致病
50、机制特别是SARS-CoV是否存在ADE作用的情况下，研究者应重视ADE现象。,八、SARS-CoV的来源 1、SARS-CoV的进化地位,可以看出，SARS病毒明显不同于同其他三个冠状病毒群，可能归属于新的冠状病毒群。和其他人类及动物冠状病毒相比，核酸序列相似性分数是0.56-0.63，氨基酸序列的相似性分数是0.57-0.74。但是，根据最新的国际病毒分类委员会（ICTV）第8次报告，SARS病毒仍归属于以牛冠状病毒为代表的第二组。,2、SARS-CoV的自然宿主 SARS病原是一个新型冠状病毒，即SARS冠状病毒(SARS-CoV)，来源于野生动物，经进化和变异实现跨种传播，导致人类SA
