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1、利用响应面法优化放线菌素X2发酵培养基,江西农业大学生物工程系熊智强 涂国全教授2005.10,中国微生物学会2005年学术年会,报 告 提 纲,前言 材料与方法 结果与分析 小结与讨论,前 言 江西农业大学生物工程系应用微生物研究室从土壤中分离筛选到一株链霉菌，简称链霉菌702,其所产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性，进一步测定它的抗菌谱，发现其所产生生物活性物质抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，同时还能抑制霉菌和酵母菌。稳定性的研究测定表明其对热和紫外线稳定，在pH3-pH12条件下稳定。这些初步研究结果已显示了其作为抗菌剂的广阔前景。,从该菌的发酵产物分离提取和纯化其抗细菌活
2、性物质，经紫外、质谱和核磁共振谱和X衍射等测定结果表明，该活性物质为放线菌素X2。但要作为抗菌剂应用于市场，首先要提高其产量，因此优化发酵培养基是其中的关键环节之一。我们采用响应面法优化链霉菌702产放线菌素X2发酵培养基，为该菌的产业化开发提供现实依据，本文报道了这一研究结果。,1、材 料,1.1 供试菌株 链霉菌702（Streptomyces 702）：由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室分离筛选获得，甘油管保存。抑菌测定指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)1.2 培养基 1.2.1 供试菌斜面、平板和茄子瓶培养基：高氏一号培养基1.2.2 种子培养基
3、(g/L)玉米淀粉10、玉米粉30、黄豆粉10、硫酸铵0.5、碳酸钙6，豆油2mL/L；1.2.3 发酵培养基(g/L)玉米淀粉20、玉米粉20、葡萄糖20、黄豆粉15、硝酸钾2.5、蛋白胨5、硫酸铵2.5、磷酸二氢钾0.3、氯化钠3、碳酸钙5，豆油10mL/L；1.2.4 指示菌斜面、平板培养基：药典号培养基。1.3 放线菌素X2（含量99.47%）:由本实验室提供。,2、方 法,2.1链霉菌702种子培养,取链霉菌702试管斜面制成孢子菌悬液，取适量体积接种于装有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30，200rpm回转式摇床振荡培养48h。,2.2链霉菌702摇瓶发酵培养,取适量链霉
4、菌702种子培养基接种于装有40mL发酵培养基的250mL三角瓶中,30，200rpm回转式摇床振荡培养96h。,2.3 链霉菌702发酵液生物效价测定：一剂量法,发酵液效价的测定采用一剂量法在金黄色葡萄球菌指示菌平板上进行抑菌测定，以放线菌素X2标准品浓度为纵坐标，以校正后的抑菌圈直径为横坐标，得到放线菌素X2标准品的标准曲线和线性回归方程。链霉菌702发酵液用无水乙醇稀释浸提，离心。上清液稀释到一定倍数后，作为抑菌测定液。按照放线菌素X2标准品标准曲线的制备方法求得发酵液的抑菌圈直径平均值的校正值，再根据相应标准曲线和发酵液样品的稀释倍数，求得每毫升样品所含的放线菌素X2的单位数。,2.4
5、 实验结果统计分析 采用SAS Version 6.2软件对实验数据进行拟合和方差分析，采用MATLAB 6.5软件进行偏导求模型极值。,3、结 果与 分 析,3.1.1 应用全因子实验设计筛选重要因素 选用四因素二水平全因子实验设计筛选影响链霉菌702产放线菌素X2的重要因素，需要16次实验，中心点做4次重复实验，共需20次实验。每个实验做三个重复，实验结果中的生物效价取三个重复的平均值。实验设计及实验结果见表1和表2。,由实验结果可以看出，放线菌素X2效价随实验条件的改变差异很大。通过SAS Version 6.2软件进行回归分析可以得到一次拟合回归方程为：Y=186.85-1.621 X
6、1+11.95 X2+13.51 X3+0.38 X4 由表4可知，F检验非常显著，用方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系显著，且X2因素（黄豆饼粉）和X3因素（工业蛋白胨）对链霉菌702产放线菌素X2影响极显著，而其余两因素对链霉菌702产放线菌素X2影响不显著。,3.1.2 应用最陡爬坡实验法接近重要因素的最优水平 最陡爬坡的方向可由上述方程及回归分析确定，X2因素（黄豆饼粉）和X3因素（工业蛋白胨）在99%的概率水平上差异显著，且系数都为正。这说明，适当增加黄豆饼粉和工业蛋白胨的用量，对放线菌素X2的产量提高有促进作用。实验设计及实验结果见表5，从表5中
7、可以看出，第5组实验中放线菌素X2的生物效价最高，这说明，最优点在第5组实验附近。,应用中心复合设计确定重要因素的最优水平 采用响应面分析方法，以黄豆饼粉、工业蛋白胨二因素为自变量，以放线菌素X2的产量为响应值。对链霉菌702的发酵培养基组成进行优化。采用中心复合设计，以表5的第5组实验为中心点。实验设计及实验结果见6,通过SAS Version 6.2软件对实验数据进行多项式回归分析，拟合的二次方程模型为：Y=998.15+94.80 x2-290.06x3-26.16x22-7.551x32-40.63x2x3 对方程用MATLAB 6.5软件进行求导，可以得到模型的极值点，即黄豆饼粉23
8、g/L(x2=1.414)、工业蛋白胨9g/L(x3=-1.414)时生物效价为1556g/mL。但此仅为模型预测值，因此需要实际发酵验证，模型验证及与优化前的培养基比较见表8。数学回归模型的方差分析见表，由表，回归模型在=0.01水平上检验极显著，图绘出了方程的三维响应面图，直观的表示出了最大值点。,3.1.4 验证实验 由表8可知，在该模型处做四次试验验证，得出响应量为1556100g/mL，此结果证实了模型有效性及存在着极大值点。,4、小 结 与 讨 论,4.1 通过响应面法优化发酵培养基配方，筛选出对放线菌素X2的重要因子黄豆饼粉和工业蛋白胨，并确定了其最佳发酵配比，即黄豆饼粉23g/L、工业蛋白胨9g/L。4.2 经优化的培养基组成后,链霉菌702摇瓶发酵产放线菌素X2的产量提高到1500g/mL，较培养基组分优化前的367g/mL提高了3.08倍。因此采用响应面法优化发酵培养基是一种行之有效的实验方法，但此研究仅限于摇瓶发酵，上罐分批发酵和补料发酵仍需进一步探索。,谢 谢！,
