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1、6 蛋白质的生物合成,第六节 蛋白质翻译后的加工和 定向运输,多肽链从核糖体被释放之后，要成为有活性的蛋白质还需要许多过程:,折叠 折叠成特定的三维结构切割 切割形成成熟的蛋白质或寡肽修饰 在氨基酸残基上加上其它基团进行修饰定位 被定位在特定的位置,蛋白质呈现功能构象的过程。构象信息被编码氨基酸序列中。,1.多肽链的折叠,折叠酶(PDI,PPI)分子伴侣,低分子量的简单多肽 体外能缓慢自身再折叠，并恢复天然构象和活性，不需要额外能量。高分子量蛋白质 包含多个结构域，其折叠需要另外一些蛋白质的协助作用。,1.蛋白质二硫键异构酶（PDI）,折叠酶,蛋白质分子中的二硫键形成与新生肽段的折叠密切相关，
2、对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。,定位于内质网管腔内，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。,能识别和水解非正确配对的二硫键，使它们在正确的半胱氨酸残基位置重新形成二硫键，从而改变二硫键的连接位置。,2.肽基脯氨酸顺反异构酶（PPI）,天然结构蛋白质包含较多顺式X-pro肽键，这些蛋白质在完成折叠时，X-pro肽键必须将反式转变为为顺式，这样折叠速率可提高300倍。,催化肽-脯氨酰之间肽键的旋转反应，根据需要催化顺/反互变的异构酶。,反式构象更有利于减少位阻干扰，但对于X-pro肽键，位阻干扰在顺式和反式构象中程度相似;,X-pro肽键的顺/反互变,组蛋白和DNA在体
3、外组装过程需要一种酸性蛋白即核质素，它能促进组蛋白和DNA组装，由此提出分子伴侣的概念。植物叶绿体的核酮糖l,5二磷酸羧化酶8个亚基，必须首先和一种蛋白质结合后才能在体内正确组装。,分子伴侣,具有结合并稳定靶蛋白不稳定构象，帮助新生肽链正确组装，促进其跨膜运输等功能，本身不是靶蛋白构成成份的一类蛋白质。,其功能类似于酶但又不同对靶蛋白专一性不高，同一个分子伴侣可以促进多种多肽链折叠成为不同的蛋白质。催化效率很低，只起阻止肽链错误折叠的作用，而不是促进其正确折叠，也不提供正确构象信息。,在分子伴侣作用的折叠过程中，时常伴随ATP的水解取得能量，在细胞胁迫时，分子伴侣的表达量常会大大增加。,热休克
4、蛋白质（heat-shock protein,HSP),能在各种不同的构象形成过程中，阻止不稳定蛋白质的聚集。热休克蛋白质是已知最好的蛋白质保护蛋白。大多数热休克蛋白质是分子伴侣，但也有的不是。热休克蛋白根据近似分子量分为：Hsp70 Hsp60,Hsp70,Hsp70多基因表达产物，组成型表达或诱导型表达包含两个结构域：氨基端的ATPase域羧基端的肽结合域,大肠杆菌 Hsp70(DnaK)的肽结合域.,Hsp60,监护蛋白或GroEL。由相同的60 kDa的14个亚基组成，并且由两个堆积的7-亚基环状结构聚集成双层饼状，具有肽链的多个结合位点。ATP、GroES多肽链在一个其它蛋白质不可能
5、进入的亲水环境里进行单独折叠。,GroEL(hsp60)的结构,多肽链的水解蛋白质的修饰蛋白质切割裂分和剪切亚基的聚合,2.肽链合成后的加工,一些新合成的蛋白质，其多肽链需要在其它酶蛋白的作用下被水解切割后才能形成成熟的功能蛋白质或功能寡肽。如胰岛素的合成：前胰岛素原胰岛素原胰岛素,多肽链的水解,激活态 失活态糖基化、磷酸化、羟基化、二硫键的形成和末端修饰（1）糖基化 一些蛋白质合成后需要糖基化变成糖蛋白或蛋白聚糖。糖基化修饰在内质网和高尔基体内进行的，进入高尔基器释放的分泌小泡内。质膜蛋白质和分泌性蛋白质具有糖链，这些附加糖基有重要生理功能，如红细胞膜上的ABO血型决定簇。,蛋白质的修饰,（
6、2）磷酸化 磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性，如促进糖原分解的磷酸化酶。磷酸化酶b 磷 酸 化 磷酸化酶a（无活性）（有活性）糖原合成酶 磷 酸 化 糖原合成酶D（有活性）（无活性）,（3）羟基化 胶原蛋白前链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟化酶、分子氧和维生素C作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸。此过程受障碍则胶原纤维不能交联，极大地降低了它的张力强度。,（5）末端的修饰 原核生物甲酰甲硫氨酸的甲酰基需经肽脱甲酰基酶水解而除去，甲硫氨酸也被氨肽酶切除。真核生物甲硫氨酸或一些氨基酸残基常由氨肽酶催化水解除去。某些蛋白质分子氨基端进行乙酰化,（4）二硫键的形成 多肽链中的二硫键是在肽链合成后
7、，通过两个半胱氨酸的巯基氧化而形成的，蛋白质二硫键异构酶在这个过程中起重要作用，对酶和蛋白质的活性是必需的。,切割:真核细胞有的基因表达产物为多聚蛋白质，翻译后被切割生成好几种蛋白质。形成多聚蛋白质的DNA中各个基因的编码序列被专一性序列隔开，这些序列能被蛋白质切割酶识别。,蛋白质切割裂分和剪接,例如，CTP生物合成途径中所需要的氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酰转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶细菌中是分别合成的酵母中合成的二氢乳清酸酶和一种大的蛋白质结合哺乳动物则合成一种包括三部分的蛋白质，随后被切割成三种酶。,蛋白质剪接 蛋白质前体可以通过多肽的剪辑被切成数个片段后再按一定顺序结合起来，最后形成有活性的蛋
8、白质。例如，红细胞凝集素、T细胞的促细胞分裂剂等蛋白质、豆类植物凝集素和伴刀豆球蛋白等都有这种加工机制。,成人血红蛋白由两条链，两条链及四分子血红素组成。先形成、二聚体再与两个血红素分子结合血红蛋白二聚体配对形成四聚体。,亚基的聚合,有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的，这就需要这些多肽链通过非共价键聚合成多聚体才能表现生物活性。,真核生物蛋白质运输1.共翻译移位与内质网结合的核糖体合成三类主要蛋白质：溶酶体蛋白、构成质膜骨架的蛋白和分泌到胞外的蛋白，它们在翻译的同时即开始移位。这些蛋白质合成的前体中，其N端都含有一段称为信号肽的序列，引导多肽到不同的转运系统。,3.蛋白质合成后的定向运输,信号
9、肽（Signal peptide）：常位于蛋白质的氨基末端，约15-30个氨基酸，引导合成中的多肽穿过内质网膜进入内质网腔，继续进行蛋白质的合成和加工。特点：（1）靠近N端部位有一个或多个带正电荷的氨基酸（2）中部由10-15个疏水氨基酸组成疏水核。（3）C端有一个可被信号肽酶识别的位点，此位点上游常为一段疏水性较强的5肽。,信号肽合成后，被胞浆中的信号肽识别颗粒SRP特异性地识别并结合。SRP的作用是将暂停翻译的新生肽链靠近内质网膜。,SRP-信号肽-核糖体-mRNA复合物被内质网外膜上的SRP受体（DP，停泊蛋白）结合，通过GTP水解的能量，打开一个通道。,进入内质网的蛋白质的去向少数留在
10、内质网 这些蛋白的羧基端含四个连续的Lys-Asp-Glu-Leu，可与内质网上的膜受体结合留在内质网中。大部分继续输送至它处，首先被传送到高尔基复合体进行糖基化加工，其中不属于高尔基体的蛋白质会被包在输送小泡内，前往溶酶体、浆膜、或储存在分泌性小泡内。前往细胞核的蛋白质具有的特定序列称为细胞核定位序列。,由细胞质中游离核糖体合成的蛋白质前体，从细胞质转移到线粒体、叶绿体、细胞核、过氧化物酶体等细胞器中。,2.翻译后移位,例如蛋白质跨线粒体膜的转运是由该前体蛋白质氨基末端的导肽所决定的。导肽约含20-80个氨基酸残基，含有较多的碱性氨基酸残基（Arg）和羟基氨基酸残基（Ser），不含或基本不含
11、带负电荷的酸性氨基酸，含两性-螺旋结构。,7 原核生物基因表达的调控,Lac operon repressor protein binding to DNA,第一节 基因表达调控概述,真核与原核生物如何调控数以千、万计的基因以最为经济、有效的时空模式进行转录，从而实现对环境的适应、细胞的分化,组织的特化，形态的发生和个体的发育。,基因表达 指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译产生有生物活性的蛋白质的过程。,基因表达调控 在不同时期和不同条件下基因表达的开启和关闭。同一细胞在不同的生存环境下，同一个体的不同细胞在不同的发育时期或不同组织
12、器官中基因表达不相同。,有些基因只转录不翻译,转录水平(transcriptional level)的调控 包括转录前、转录和转录后加工过程。翻译水平(translational level)的调控 指从mRNA翻译成多肽链的调控，包括翻译和翻译后加工过程。,原核生物基因转录和翻译可在同一时间和位置上发生，基因表达的调控主要是在转录水平上进行的。,组成型表达 维持细胞生命活动必需基因的表达基本不受调控，其表达产物大致以恒定水平始终存在于细胞内。这类基因称为管家基因(housekeeping gene)。如生物代谢过程中所需要的各种酶或蛋白质的基因以及构成细胞结构成分的基因就属这一类型。,可调型
13、表达 基因的表达是受到严格调控，只有在一定的细胞类型、发育时期及环境条件下才表达。这类基因称为可调基因（regulatedgene）。,应环境条件变化，基因表达水平增高的现象称为诱导，这类基因称为可诱导的基因。随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏，这类基因称为可阻遏的基因。细胞中有一些特殊蛋白质调控着可诱导基因和可阻遏基因的表达，这类蛋白质称为调节蛋白。阻遏蛋白可关闭其靶基因的表达，激活蛋白可打开所调控基因的表达。,基因表达的时间特异 某一基因的表达严格按特定的时间顺序发生。例如，昆虫变态过程的各种基因要在一定发育阶段才能表达。基因表达的空间特异性 在生物生长发育过程中，不同组织细胞
14、中基因表达的数量、强度和种类各不相同。例如，与植物成花有关的基因也只有在花原基形成时才表达，而在营养生长阶段则全被关闭，并且在营养器官和生殖器官的基因表达不同。,第二节 原核生物基因表达的调控,法国Jocob和Monod等1961年提出了乳糖操纵子模型。操纵子的基本组成元件包括：结构基因（structural gene）启 动 子（promoter，P）操纵基因（operator，O）,操纵子模型（lac operon）,2.启动子 操纵子至少有一个启动子。不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同，启动转录的频率高低不同，分为强启动子和弱启动子。,1.结构基因(structural g
15、ene,SG)：操纵子中编码蛋白质的基因称为结构基因。各结构基因串连排列组成结构基因群，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA。,3.操纵基因（operator gene）能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵基因序列上，会影响其下游基因的转录。,4.调节基因（regulatory gene）编码能与操纵基因序列结合的调控蛋白的基因，其基因产物与操纵基因结合后能减弱或阻止结构基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白，介导负调控；与操纵基因结合后能增强或起动结构基因转录的调控蛋白称为激活蛋白，介导正调控。5.终止子（terminator，T）给予R
16、NA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。,一些分解代谢酶类的基因只有在底物或底物类似物存在时才被诱导转录。,参与合成代谢的酶类的基因在产物或产物类似物足量存在时才被阻遏。,乳糖操纵子的结构,大肠杆菌乳糖操纵子模型,乳糖操纵子,阻遏蛋白的负调控,细菌生长在无乳糖的培养基中时，lac I 基因表达产生蛋白R，R蛋白特异性地与操纵基因O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合，使1ac操纵子处于阻遏状态。乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白的特定部位结合，其构象改变，R与操纵基因解离，发生去阻遏作用，诱导了lac操纵子基因的开放，-半乳糖苷酶在细胞内的含量
17、可增加1000倍之多。,Repressor 38 kd/monomer,当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，细菌通常优先利用葡萄糖，cAMP含量低，lac操纵子不表达，当环境中无葡萄糖时，cAMP含量升高，lac操纵子表达。,降解物基因活化蛋白（CAP）的正调控,没有调节蛋白时操纵元内结构基因的转录活性是关闭的，而加入调节蛋白后结构基因转录活性被开启，这种调节方式称为正调节。,cAMP可与CAP结合，CAP与cAMP特异结合后构象改变而活化。当cAMP-CAP复合物与1ac操纵子的启动子上游CAP位点结合时，可使DNA发生94度弯曲，促进了RNA聚合酶与启动子形成稳定的开放型转录起始复合物，从
18、而使lac操纵子得到表达。,每一种调控蛋白分别响应一种环境信号并将其传递给lac基因。CAP介导葡萄糖信号,而阻遏蛋白介导乳糖信号:阻遏蛋白只在乳糖缺乏的时候才结合DNA从而抑制转录,在乳糖存在时,基因表达。CAP只在没有葡萄糖的时候才结合DNA从而激活lac基因。这样两种调控蛋白联合作用保证基因在乳糖存在,同时缺少葡萄糖的环境中以显著水平表达。,小 结,色氨酸操纵子（Tryptophane operon）,生长在不含任何氨基酸的培养基中的大肠杆菌，细胞中含有合成20种氨基酸所需要的全部酶类。而当培养基中含有某种氨基酸时，则该种氨基酸生物合成的酶类几乎完全缺失，即生物合成的酶类受其终产物的抑制
19、。如色氨酸为色氨酸生物合成酶类的终产物，色氨酸作为辅阻遏物与调控蛋白结合而阻遏色氨酸操纵子的表达。,Trp操纵子的结构,包括5个结构基因组成的一个转录单位，由共同的启动子起始转录，生成多顺反子mRNA。产生阻遏蛋白的基因距离操纵子很远。转录形成的 mRNA 5端还有一段被称为前导序列的mRNA片段参与调控转录。,trp操纵子的调控系统,粗调控阻遏调控 调控基因trp R表达无活性的阻遏蛋白，当培养基中有足够的色氨酸时，色氨酸作为辅阻遏物激活阻遏蛋白，活化的阻遏蛋白与操纵基因结合。由于trp操纵子的启动子与操纵基因的区域有很大程度的重叠，阻遏蛋白的结合阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合，导致trp
20、操纵子关闭。,前导序列 在trp操纵子转录形成的 mRNA 5端有一个长l62 bp 的mRNA片段。培养基中有色氨酸时，转录总是在这段序列终止，产生个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，且随色氨酸浓度升高而降低转录作用，这个区域就被称为衰减子。,精细调控衰减调控,衰减子的mRNA碱基序列可以通过自我配对形成茎环结构，有典型的终止子特点。前导序列包括有起始密码子AUG和终止密码子UGA，它可编码一个14个氨基酸的前导肽。,稀有密码子对翻译的影响核糖体蛋白基因表达在翻译水平的调控细菌营养缺乏调控反义RNA对基因表达的调控,2.转录后调控,稀有密码子对翻译的影响,大肠杆菌DNA复制
21、时的RNA引物是由dnaG基因编码的引物酶催化合成的，细胞对这种酶的需求量很小，若引物酶过多还将导致细胞死亡。dna G和rpoD、rps U基因属于同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上相差甚远，原因在于dna G序列中较高频率地使用了不少稀有密码子。稀有密码子对应低丰度的tRNA，翻译速度受tRNA供应的限制，影响了蛋白质合成的总量。,核糖体蛋白基因表达在翻译水平的调控,在核糖体组装时，与rRNA结合的蛋白为关键蛋白，它抑制整个操纵子的表达。当核糖体蛋白的mRNA多时，则关键蛋白较多地与核糖体蛋白的mRNA结合，导致其不能与rRNA结合形成核糖体。通过这种调控，核糖体蛋白的合成速度就不会超
22、过构建核糖体的速度。,核糖体蛋白与mRNA结合并不影响核糖体的形成，这是因为核糖体蛋白与核糖体RNA的结合比其与mRNA的结合更紧。只有当核糖体蛋白的生产超过核糖体RNA时，翻译的阻遏才会发生。,细菌营养缺乏调控,细菌在葡萄糖缺乏时产生报警物质cAMP。以打开lac操纵子、gal操纵子或ara操纵子等，这样可保证其利用其它糖类。GTP+ATPpppGpp+AMPppGppppGpp的作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，从而成为细胞内严紧控制的关键。ppGpp也可抑制核糖体和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操纵子的转录表达，抑制与氨基酸运转无关的转运系统，活化蛋白水解酶等。,反义RNA对基因表达的调控,反义RNA（antisense RNA）是指与靶RNA具有互补序列的调控RNA。反义RNA能通过互补序列与特定的靶mRNA结合起负调控作用。通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内转录出反义RNA，即能抑制特定基因的表达。反义RNA技术,P35S:Chs,dsRNA,高通量研究基因功能研究信号传导通路的新途径开展基因治疗的新策略,RNAi Applications,
