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1、双向电泳的操作,2007-7-4,步骤,样品制备（Sample preparation）固相pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（IPG strip equilibration）第二向SDS 电泳（SDS-PAGE）检测染色（Detection/Staining）蛋白点的挖取，收集质谱分析,总的策略,参考资料,http:/蛋白质组学导论-生物学的新工具(2005)D.C.利布莱尔 著蛋白质化学与蛋白质组学(2004)夏其昌 编著,一般性原则,尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失减少对蛋白质的人为
2、修饰破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态,样品制备需要的试剂,离液剂(chaotropes):尿素（Urea）和硫脲（thiourea）表面活性剂（sufactants）也称去垢剂：NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂 CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂还原剂（reducing agents）二硫苏糖醇（DTT）二硫赤藓糖醇（DTE）磷酸三丁酯（TBP）选择性的加入 Tris-base 蛋白酶抑制剂（如EDTA、Pefabloc protease inhibitor、PMSF or Protease inhibitor cock
3、tails）核酸酶,影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质,核酸 超声或核酸酶处理脂多糖 超速离心除去盐类小分子 透析可以降低盐浓度，但时间太长 采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。,常用裂解液,UreaThioureaCHAPSDTTPharmalyte pH 3-10Tris-BasePefabloc protease inhibitor1%SDS,样品制备程序,培养细胞（culture cell）样品处理方法（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的
4、PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100L 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5）4，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78 备用。,组织样品处理方法 三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）超速离心法,BACK,IPG 胶条的水化,加样品水化不加样品水化,加样品水化,加样品水化,BACK,IEF,限流 50uA200V 1hr500V 1hr1000V 1hr8000V 30min gradient8000V 5hr(40000Vh)500V 维
5、持,BACK,IPG strip equilibration,BACK,分装40ml 贮存于-20这是一个贮存液。用之前在加1%DTT 或者2.5%碘乙酰胺。,第二向SDS 电泳（SDS-PAGE）,BACK,2-DE 胶蛋白质点的检测,1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法。,考马斯亮兰染色法,经典的考马斯亮兰染色（R-250）局限：灵敏度低（1g protein/spot）Neuhoff 胶体考染法 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot热考马斯亮兰染色及二次染色法.,银染法,银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上。,SYPRO Ruby 蛋白染色(荧光),Bio-Safe 考马斯蓝染(可见光),银染(可见光),背景信息,不同的染色方法,BACK,
