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1、天然产物的提取分离和结构鉴定,第二章,天然药物活性成分的研究程序,提取化学成分的两种情况,2,对有效成分的性质一无所知,水蒸气蒸馏法,升华法,分馏法,沉淀法,提取天然产物的常用方法,一、溶剂法,根据相似相溶原则，按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂来选择溶剂。,1.原理：溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分溶解出来的方法。,石斛：有一定解热镇痛作用，能促进胃液分泌,助消化，有增强新陈代谢、抗衰老等作用。,2、常用溶剂的极性,环己烷,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇
2、,小 大,极性：,3.化学成分的极性特点,分子越小,取代基极性越强,极性基团数目越多则极性越大，亲水性越强,为亲水性成分（如:单糖）反之,则亲脂性越强,为亲脂性成分（如:挥发油）取代基的极性顺序：-COOH-OH-NH2-SH-CHOC=O-COOR-OR-CH=CH-CH2-CH2-,例：下列三个化合物极性最小的是：,C,4、溶剂提取法,浸渍法,渗漉法,煎煮法,回流提取法,浸渍法：浸渍法是将天然产物粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。,渗漉法：渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出
3、浸出液的一种浸出方法。,煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。,回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。,二、水蒸气蒸馏法,适于随水蒸汽蒸馏而不被破坏的成分。将油层分出后，再以石油醚、乙醚萃取。此类化合物沸点多在100oC以上；与水不互溶或仅微溶；在100oC有一定的蒸汽压。液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出。,例如:挥发油、某些小分子生物碱的提取。,三、升华法,优点：简便
4、易行缺点：成分分解；焦油状物不易除去,四、影响提取效果的因素,原料的粉碎程度：一般而言粒度以2060目为适。,浸出温度：一般浸出温度控制在60100。,浓度差:浓度差越大，扩散推动力越大，越有利提高浸出效率。,浸提时间:热提13h，乙醇加热回流提取12h。,天然产物有效成分的分离与精制,根据物质溶解度差别进行分离,根据物质在两相溶剂中的分配系数不同进行分离,根据分子的大小不同进行分离,一、根据物质溶解度差别进行分离,1、结晶,原理：利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不 同来达到分离提纯的目的。,结晶溶剂的选择：（1）不与有效成分发生反应（2）对欲结晶成分的溶解度随温度的不同而有明显差别。（3）
5、对欲去除的杂质冷热时溶解度均大或均小,制备结晶操作：略,结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一可以作为鉴定的初步依据。,2、溶剂沉淀：在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。,3、沉淀剂沉淀：（1）金属离子沉淀；（2）酸碱沉淀；（3）非离子型聚合物沉淀；（4）均相沉淀。,4、盐析沉淀,二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 一、液-液萃取法基本原理 分配定律,利用不同化合物分配系数的不同，达到分离的目的K相差越大，越易分离,3、萃取方式分次萃取 实验室用分液漏斗，3-4次,注意以下几点：,1）先用小试管猛烈振摇约1分钟
6、，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。,2）一般萃取34次即可。,3）溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取一般为水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。,4、超临界流体萃取技术,超临界流体萃取是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分的一种方法。,3液液分配色谱柱,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂(流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得
7、以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。,正相色谱与反相色谱,三、根据物质分子大小差别进行分离,凝胶过滤法（Gel filtration）,凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱排祖色谱，是利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。,出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。,色谱分离方法薄层层析（Thin Layer Chromatography,TLC）1、原理 吸附、分配,2、展开剂 低沸点有机溶剂，选择原则同吸附柱层析,（1）化合物结构与Rf值的关系,在色谱中一个化合物所移动的距离与溶剂前沿的距离之比.(0.01Rf
8、0.99),吸附薄层层析：化合物极性小，Rf值大 展开剂极性越大，同一化合物Rf值大,若大部分斑点近于起始线，表明溶剂极性太小，应加大极性溶剂的比例。,某化合物用10ml氯仿作展开剂,薄层色谱后其Rf值很小,接近于起始线,该如何处理?加大展开剂的极性:改变组成:如氯仿-丙酮，氯仿-甲醇，改变配比:如9:1,8:2,5:5,(2)展开剂的选择 不与样品起化学反应 对显色剂无不良影响 组分恒定,不因温度的变化而变化 被分离物的Rf值在0.05 0.85,二种成分的Rf值之差大于0.05，以免斑点重叠。鉴定单一化合物Rf值在0.4 0.6，斑点圆而集中，界线清晰，分布适中。,（3）展开形式 单向,双
9、相和连续展开,广谱方法：碘：挥干溶剂，置于碘缸，许多物质与碘产生棕色点 喷洒稀硫酸，加热 UV灯下观察荧光,（5）样品洗脱：色带割下，溶剂洗脱7、TLC法的特点 分离多种类型的化合物 简便、高效、快速（几分钟-十几分钟）、灵敏（g级）定性：Rf值，与已知物对照 定量：测量斑点面积，割下斑点洗脱或TLC扫描仪 为柱层析选择条件 制备：分离、纯化 缺点：处理的量少,四、干柱层析 干柱：填充剂干法装（一）原理 与TLC相同（二）填充剂 与TLC相同 易分离样品（Rf 0.1），粗颗粒（150-200目）难分离样品（Rf 0.1），细颗粒（200-300目）（三）展开剂 TLC选择，各斑点 Rf相差大
10、，斑点圆，数量多,（四）实验操作 1、装柱 坚实、平整、无缝隙 尼龙筒或塑料薄膜袋2、加样（1）拌样加样法（2）溶液加样法 迅速、盖满柱顶，轻拍，赶走气泡，保持柱顶整齐3、展开 展开至柱底,（五）特点1、广泛应用于植化成分的制备性分离2、效果优于湿法3、分离条件可用TLC探索4、荧光或有色物质可在UV下分离切开，避免交叉5、设备简单、消耗溶剂少、省时缺点：装柱不当，效果不如湿法,天然药物活性成分的结构研究方法,一、程序1、初步推断化合物类型1）根据样品在提取、分离中的行为 2）测定有关理化性质：定性反应、PH、溶解度及熔沸点等 3）结合文献调研2、测定分子式、计算不饱和度 1）元素定量分析+分子量测定 2）同位素峰法 3）HIMS 4）计算不饱和度3、确定分子中官能团、或结构片段或基本骨架 1）官能团定性、定量分析 2）测定并解析图谱：UV、IR、MS、H NMR、C NMR,4、推断并确定分子的平面结构 1）综合解析结构 2）与已知物沟通（化学降解、衍生物、人工合成）5、推断立体结构 1）测定CD、ORD谱 2）NOE 3）X-ray 4）人工合成,
