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1、实验二细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色,目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。实验内容：1、细菌抹片的制备：玻片准备：透明、洁净、无油渍。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。2、细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、细菌常用染色方法：革兰氏染色法,细菌抹片 的制备,革兰氏染色法：1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。2.初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。4.脱
2、色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（2030秒），立即水洗。5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。,革兰氏染色法原理：革兰氏染色法将细菌分为G和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低
3、，使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。,G+菌与G-菌细胞壁的区别,细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌 强 度 较坚韧 较疏松 厚 度 2180nm 1015nm 肽聚糖层 可达50 层 12层 肽聚糖量 50%80%5%80%糖类量 约45%15%20%脂类量 1%4%1122%磷壁酸 外 膜,革兰氏染色法过程示意图,革兰氏染 色法动画,革兰阳性菌 革兰阴性菌,革兰氏 染 色法,革兰氏染 色法动画,实验报告：1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。,细菌的单染色,细菌抗酸染色,1.初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2.脱色:3%盐酸酒精脱色30秒1分钟；用水冲洗。3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。,
