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1、实验二,细菌的人工培养,实验目的,了解人工培养基的制作。了解细菌的接种方法 分离培养方法平板划线法（混合菌液）了解细菌的生长现象液体、固体、半固体培养基,一、人工培养基的制备和种类,1.制备原则2.制备程序 3.常用培养基的分类,1.制备原则,（1）适当的营养成分；（2）合适的酸碱度；（3）配制后经灭菌使之无菌，方可应用。,2.制备程序,配料熔化测定及矫正PH分装灭菌备用,配制方法（1）称量 分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。（2）溶化 加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。（4）定
2、容 将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。（5）加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。（6）分装、加塞、包扎。（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。,LB培养基的配制：成分：胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母提取物(yeast extract)5g氯化钠(NaCl)10g、固体培养基另加 琼脂粉 15-20g，加双蒸水至1000mL,用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121灭菌30min。,按物理状态不同划分,固体培养基,液体培养基,在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%,琼脂含量一般为0.3%-0.5%,不加任何
3、凝固剂,半固体培养基,固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏,观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定,用于增菌，大规模工业生产及在实验室进行微生物的研究,3.常用培养基的分类,按用途不同划分,基础培养基,鉴别培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物。比如 肉汤培养基。,选择培养基,利用细菌代谢产物不同而使指示剂显色反应不同的原理，鉴别和鉴定细菌。如麦糠凯琼脂培养基。,营养培养基,在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。如SS琼脂培养基。,在基础培养基中加入
4、某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如血琼脂培养基。,特殊培养基,如厌氧培养基。用于厌氧菌的培养。,3.常用培养基的分类,二、细菌的接种技术 分离培养接种法平板划线法、平行划线法纯种细菌接种法 固体斜面培养基接种法 液体培养基接种法 半固体培养基接种法,无菌操作：,在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行,常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。,图6,接种工具,细菌分离培养接种法的原理,根据机械分离作用，在无菌培养基中从混杂的标本中分离出所需的单个细菌生长繁殖所形成的菌落。,1、以无菌操作用接种环取待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余
5、的菌种。2、将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约45度角）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。3、划线时平板面与接种环面成30-40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环。4.用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3区依次划线。5.每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域6.每一区域的划线均接触上一区域的接种线12次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。其他操作与上述曲线划线分离法相同。,斜线(分区)划线分离法,划线接
6、种注意要点,划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5.划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复.每次划完后接种环应灭菌.,1、琼脂斜面接种法,菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物；培养基：斜面固体培养基；用途：扩增细菌、保存菌种；或用于观察其某些生化特性。,纯种细菌接种法,2、液体接种法,菌种：葡萄球菌或大肠埃希菌、枯草杆菌等普通琼脂培养物；培养基：液体培养基；接种方法：液体接种法。从斜面菌种接入液体培养液；从液体培养液接入液体培养液；用途：扩增细菌，用于观察
7、细菌的生长特性或测定其生化特性。,纯种细菌接种法,3、半固体穿种接种法,菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物；培养基：半固体培养基接种方法：穿刺接种法。用接种针垂直地穿入培养基中心至底部；然后沿着原接种线将针拔出。用途：检验细菌的运动性或观察细菌的生化反应。,纯种细菌接种法,（1）固体培养基,形成菌落和菌苔。观察菌落的大小、形态、透明度、颜色、表面和边缘情况及菌落周围有无溶血环等。,三.细菌生长现象观察（示教）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。,（2）液体培养基,均匀混浊生长菌膜形成（专性需氧菌）沉淀生长（多见于链状排列的细菌）,（3）半固体培养基,可用于观察细菌有无动力。痢疾志贺菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰，周围培养基仍为透明，动力阴性；大肠埃希菌沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线模糊，整个培养基变成混浊，动力阳性。,本次实验课结束作业看结果后由组长收齐交上来，值日同学留下下次上课内容：消毒灭菌和药敏试验 再见！,
