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1、实验六、自酿啤酒,一、实验原理,啤酒是以麦芽为主要原料先制成麦汁，添加酒花，再用啤酒酵母发酵而制成的一种酿造酒。啤酒生产过程主要分为：麦芽制造（制麦）、麦汁制备（糖化）、发酵、灌装四个部分。啤酒工业化生产可采用传统发酵槽工艺或大型露天发酵罐发酵。小型啤酒酿造设备常用于宾馆饭店和啤酒吧等鲜啤酒的制造。啤酒酿造要把握好以下主要技术问题：啤酒酵母菌株的选择、大麦发芽、麦汁的组分、酵母接种量和接种技术、起酵温度和发酵温度、发酵设备和酵母在发酵中的流态、发酵（或双乙酰还原）条件选择、酵母分离时间和方法、贮酒条件和时间、发酵中压力或CO2的浓度、啤酒过滤方法以及灌装杀菌等。可见啤酒的生产过程比较复杂，涉及
2、和应用到微生物学、生物化学、酶学、化工原理、机械设备和发酵工艺等方面的理论和技术。,二、实验目的,通过啤酒的酿造实验，熟悉和掌握啤酒生产工艺过程，包括麦汁制备、酵母活化培养、啤酒发酵控制的措施和方法；熟悉和掌握啤酒酿造的原理、设备及操作。,三、实验材料和设备,1.实验材料大麦或麦芽、大米、啤酒酵母、淀粉酶、麦芽汁琼脂培养基、麦芽汁液体培养基等。2.实验仪器和设备温度计、糖度计、台秤、天平、生化培养箱、麦汁煮沸罐、过滤机、灌装压盖机、啤酒瓶、皇冠盖等。,四、实验内容,根据实验条件可以选择不同的实验内容和重点。可以从麦芽制造开始到成品啤酒，也可以从麦汁制备（糖化）开始；可以生产熟啤酒或酿造鲜啤酒。
3、啤酒生产的全过程如下：原料大麦粗选精选分级大麦称量贮藏浸麦湿大麦发芽绿麦芽干燥除根干麦芽贮藏成品麦芽粉粹麦芽粉（大米粉糊化对醪）糖化保温过滤（加酒花）煮沸冷却（加啤酒酵母）发酵贮酒过滤杀菌罐装成品,下面从麦汁制备开始简述实验方法。,1.麦芽汁的制备（俗称糖化）准确称取麦芽粉280g，倒入糖化锅，加54热水990mL，搅拌混匀，于5052 保温60 90min。准确称取大米粉130g，倒入糊化锅，加入50 的热水630mL，并加入-淀粉酶（6U/g大米粉），搅拌均匀，于80 85 保温30 40min。将糊化锅中的缪液升温至100，迅速倒入糖化锅中，混匀，于68 保温60 90min。其间用碘液
4、进行检查，直至糖化完全。将糖化完全的缪液（糖化缪）升温至78 后，倒入过滤槽，静置10min后进行过滤、洗槽处理。将过滤和洗槽得到的麦芽汁合并，加入0.12%的酒花，煮沸90min。酒花亦可分次加入，目前国内啤酒生产厂家通常分三次或四次加入酒花，例如，第一次是在通麦汁初煮沸时，加入酒花用量的五分之一，第二次是在煮沸40min后，加入酒花用量的五分之二，第三次在煮沸终了前10min，加入剩下的五分之二。煮沸结束后，用糖度计测定麦芽汁浓度，并加入热水使之合乎要求（啤酒成品的酒度）。降温，经分离出酒花的麦芽汁从95 98 急速冷却至适合于发酵的温度6 8。麦汁冷却后增加了麦汁中的溶解氧，有利于酵母生
5、长繁殖。,2.低温发酵法生产啤酒的操作步骤,发酵罐的清洗和灭菌处理。用2%氢氧化钠冲洗锥形发酵罐，然后以清水冲洗至pH7，用2%的甲醛溶液浸泡2h以上，再以清水冲洗至无甲醛味。使用前用75%乙醇（或80热水）灭菌。将麦芽汁冷却后装入发酵罐，接好冷却设备，对啤酒酵母进行扩大培养。斜面试管试管培养三角瓶扩大培养。加入0.8%泥状酵母，接种温度9 10，进行低温发酵。发酵过程要严格控制发酵温度，及时观察啤酒产气情况，避免造成杂菌污染而出现异常发酵。发酵时间一般为1520天。主发酵时间为7 8天，发酵温度最高不超过15，最好以发酵温度6 9 为宜，发酵终了温度为4。后期期间采用“先高后低”的温度控制原
6、则，3 保持1.5天左右，然后至1.5 1天，贮0 1，时间5 7天左右。,3.过滤、杀菌、包装,将贮好的啤酒经过过滤装置进行过滤，得到澄清透明的酒体。再进行巴氏杀菌，最后进行罐装成为成品。,4.产品评定,对啤酒成品进行感官评定、理化指标和卫生指标方面评定。感官评定包括外观、色泽、香气、滋味。理化指标包括原麦汁含量（%）、总酸、糖度、色度、pH、氨基酸含量等。卫生指标包括细菌总数、大肠杆菌数、致病菌等。,五.问题讨论,1.糖化过程中麦芽中各种酶的作用是什么？2.菌种扩大过程中为什么要慢慢扩大，培养温度为什么要逐级下降？3.麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响？4.如何应用酵母菌的生理特性指导啤酒
7、酿造？,附属实验项目,实验一、酵母扩培实验二、麦芽质量指标的测定实验三、啤酒中双乙酰含量的测定,实验一、酵母扩培实验,1.平板分离培养法(稀释分离法),平板分离培养法,啤酒纯种酵母的分离培养方法,2.划线分离培养法,1,2,3,4分别表示第1,2,3,4次划线区,3.林德奈氏单细胞分离培养法,林德奈氏小滴培养法,啤酒酵母的实验室扩培,酵母扩培过程扩培工序分段工序分段原因,斜面试管（原菌种）富氏瓶或试管培养 巴氏瓶或三角瓶培养 卡氏罐培养 汉生罐培养 酵母扩大培养罐 酵母繁殖罐 发酵罐 以上从斜面试管到卡氏罐培养为实验室扩大培养阶段；汉生罐以后为生产现场扩大培养阶段 麦汁量大时，送输很困难，不能
8、再在实验室进行酵母扩培。因此，需要在车间的酵母扩培设备中继续进行扩大培养。运输设备卡氏罐,扩培容器容积与接种麦汁量,注意事项 酵母繁殖分几次进行，把处于高泡阶段的培养液倒入大约10倍的容器中。为保证酵母良好快速的生长繁殖，一般扩培倍数不超过10倍。,实验室扩大培养的技术要求,（1）一切培养用具必须彻底刷洗干净，塞好棉塞，干热灭菌，灭菌温度170左右；（2）培养用的培养基，应使用现场加酒花的麦汁，加热煮沸并加蛋白澄清，利用蒸汽间歇灭菌后，在25保温箱中贮存23天，证明无污染后，方可使用；（3）每次扩大稀释倍数约10倍以下；,实验室扩大培养的技术要求,（4）每次移植接种后，要镜检酵母细胞的发育情况
9、；（5）随着每阶段的扩大培养，培养温度逐步降低，以适应现场发酵情况；（6）每个扩大培养阶段，均应做平行培养：试管45只，巴氏瓶23个，卡氏罐2个，选择优者进行扩大培养。,一种简易的酵母扩培方法,试管小三角瓶45L大三角瓶 200L金属带盖容器在小发酵池中增殖和发酵（进入生产）采用这种方式进行扩培，人们很方便地就可以将酵母培养液扩大化至35吨从试管到三角瓶的酵母培养要使用无菌麦汁，之后的培养过程则全部使用生产麦汁,实验二 麦芽质量指标的测定,一、目的与要求1.通过对麦芽主要质量指标的测定，以达到综合应用各种分析方法的目的，综合训练食品分析的基本技能，掌握食品分析的基本原理和方法。2.根据实验任务
10、学会选择正确的分析方法以及学会合理安排实验的顺序和实验时间。3.正确应用“直接干燥法”、“碘量法”、凯氏定氮法、“茚三酮比色法”及“折光法”、“密度法”等基本技术，学会正确分析实验影响因素。,二、实验原理及相关知识（一）实验任务麦芽是麦芽厂和啤酒厂麦芽车间的产品，同时又是酿造啤酒的主要原料，麦芽的质量直接影响啤酒的质量。而麦芽质量的好坏主要由水分、糖化力，蛋白质含量、蛋白溶解度、及-氨基氮等指标决定，本实验根据麦芽的主要质量指标，要求分析下列项目：1.麦芽水分含量；2.麦芽渗出率；3.麦芽糖化力；4.麦芽蛋白质含量；5.麦芽蛋白溶解度；6.麦芽-氨基氮含量；,（二）实验原理及相关知识1.麦芽水
11、分含量麦芽水分是麦芽质量控制指标之一，水分大，会影响麦芽的浸出率，质量要求麦芽使用时水分5%。常用直接干燥法，其原理是：在一定的温度（95105）和压力（常压）下，将样品放在烘箱中加热干燥，除去蒸发的水分，干燥前后的质量之差即为样品的水分含量。2.麦芽渗出率麦芽渗出率与大麦品种，气候和生长条件、制麦方法有关，质量要求优良麦芽无水浸出率为76%以上，常用方法有密度瓶法、折光法，可根据麦芽汁相对密度查得的麦芽汁中浸出物的质量百分数，计算渗出率，或根据麦芽汁折光锤度（质量百分数）直接初算渗出率。,3.麦芽糖化力麦芽糖化力是指麦芽中淀粉酶水解淀粉成为含有醛基的单糖或双糖的能力。它是麦芽质量的主要指标之
12、一，质量要求良好的淡色麦芽糖化力为250WK以上，次品为150WK以下。麦芽糖化力的测定常用碘量法，其原理是麦芽中淀粉酶解成含有自由醛基的单糖或双糖后，醛糖在碱性碘液中定量氧化为相反的羧酸，剩余的碘酸化后，以淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验，从而计算麦芽糖化力。,4.麦芽蛋白质（总氮）含量麦芽蛋白质一般为8%11%（干物质），常用微量凯氏定氮法。5.麦芽蛋白溶解度（氮溶指数）麦芽蛋白溶解度是用协定法麦芽汁的可溶性氮与总氮之比的百分率，比值愈大，说明蛋白质分解愈完全。麦芽质量要求蛋白溶解度41%为优；3841%为良好；3538%为满意；35%为一般。常用凯氏定氮法，分别用麦芽粉样和
13、协定法麦芽汁样与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氮游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据标准酸的消耗量可计算出麦芽总氮和可溶性氮。,6.麦芽氨基氮含量麦芽氨基氮含量是极为重要的质量指标。部颁标准规定良好的麦芽每100克无水麦芽含氨基酸毫克数为135150。大于150为优，小于120为不佳。在啤酒行业中常有茚三酮比色法和EBC2，4，6一三硝基苯磺酸测定法（简称TNBS法），推荐茚三酮比色法：茚三酮为一氧化剂，它能使氨基酸脱羧氧化，生成CO2、氨和比原来氨基酸少一个碳原子的醛，还原茚三酮再与氨和未还原茚三酮反应，生成蓝紫
14、色缩合物，产生的颜色深浅与游离氨基氮含量成正比，在波长570nm处有最大的吸收值，可用比色法测定。,（三）实验方案设计提示1.根据样品测定项目设计实验方案。2.选择样品提取和预处理方法，及根据误差的要求和实际需要选择恰当的天平仪器和玻璃量具。3.方案设计时可以参考相关知识，或其他资料。4.请根据实验任务以及实验室提供的仪器和试剂合理安排实验实施方案。,三、仪器与试剂（一）实验室提供下列仪器和试剂1.仪器：（1）鼓风恒温干燥箱；（2）各种分析天平；（3）干燥器；（4）称量皿；（5）凯氏消化装置；（6）改良式凯氏定氮蒸馏器；（7）恒温水浴锅及电动搅拌器；（8）搪瓷杯或硬质烧杯；1、垫 2、支架 3
15、、凯氏烧瓶 4、电炉（9）分光光度计；（10）阿贝折光仪、密度计。,（1）测蛋白质各种试剂（2）测糖化力试剂：硫代硫酸钠标准溶液：（0.1mol/L）称12.5g Na2S2O35H2O于250mL烧杯中，用新煮沸且已放冷的蒸馏水溶解后，移入500mL棕色瓶中，加入0.1g Na2CO3，用上述蒸馏水稀释至500mL，摇匀，放暗处714天后，按GB601配制与标定。PH4.3乙酸一乙酸钠缓冲溶液；称取30g分析纯乙酸用蒸馏水稀释至1000mL，另称取34g分析纯乙酸钠（CH3COONa3H20）溶于蒸馏水中并稀释至500mL。将两溶液混合，其PH为4.30.1。氢氧化钠溶液（1mol/L）：称
16、取40g氢氧化钠，用水溶解至1000mL。硫酸溶液（1mol/L）：量取28ml浓硫酸，缓缓倒入适量水中并衡释至1000mL，冷却，摇匀。碘溶液（0.1mol/L）：称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中并稀至1000mL，摇匀，保存于棕色具塞瓶中。可溶性淀粉（分析纯）,（3）测氨基酸试剂：茚三酮显色剂：称取100g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、60g磷酸二氢钾（KH2PO4）、50g水合茚三酮和3g果糖，用水溶解后稀释至1000mL，（此溶液在低温下用棕色瓶子可保存2周，PH应为6.66.8）。碘酸钾稀释液：称取2g碘酸钾溶于600mL水中，再加入95%乙醇400mL，混匀
17、。甘氨酸标准溶液：准确称取干燥的甘氨酸0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释毛标线，摇匀，0贮藏。临用时按要求稀释、此液为200mg/L氨基酸标准溶液。,（二）学生自行准备的仪器和试剂1.安装改良式凯氏定氮蒸馏装置。2.配制2%可溶性淀粉溶液：称取2g可溶性淀粉，加少量蒸馏水调成糊状，倾入100mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却。3.标定盐酸标准溶液（0.01mol/L）；按GB601配制与标定。,四、实验步骤提示,（一）样品处理1.麦芽粉的制备按取样法先取少量样品倒入粉碎机中，用以洗涤粉碎机，然后倒入样品进行粉碎，使用60目筛过筛，使细粉含量达90%
18、以上。如表皮不能一次磨成细粉，需反复粉碎，直至达到要求。供分析水分、总氮含量用。,2.麦芽渗出液的制备（1）称取粉碎麦芽样20.00g，（深色麦芽为40.00g）置于已知质量的搪瓷杯或硬质烧杯中，加蒸馏水480mL。（2）于40水浴中，在40恒温下搅拌1h（搅拌机转速为1000转/分）。（3）取出渗出杯，冷却至室温，补充水使其内容物质量为520.0g（深色麦芽为540.0g）。（4）搅拌均匀后，以双层干燥滤纸过滤，弃去最初滤出的100mL滤液，返回重滤，重滤后，滤液为麦芽渗出液,供分析糖化力用样。,3.协定法麦芽汁的制备：（1）称取粉碎麦芽样50.0g放入已知质量的糖化杯中，加入200mL蒸馏
19、水（一般为4647），使混合后恰好达到45保温30min。（2）以每分钟升温1的速度升温，在25min内升至70，此时于杯内加入100mL70水。（3）在70保温1h后冲洗搅拌器，取出糖化杯，在1015min内急速冷却到室温。（4）擦干杯处壁水分，补加水准确使其内容物质量为450g。（5）搅拌均匀后，以双层干燥纸过滤，最初滤出的100mL滤液反回重滤，重滤后的溶液为协定法麦汁,供分析相对密度，可溶性固形物，可溶性氮，氨基氮等用。,（二）测定方法1.直接干燥法测定麦芽水分含量（1）步骤 称取粉碎麦芽约5g，称量准确至0.001g，放入已称至恒重的称重皿中，弄平立即盖好，操作愈迅速愈好。称重皿置干
20、燥箱中，将盖取下，在105107下干燥3h。趁热将称重皿盖好，取出，置干燥器中冷却半小时后称重。再重复烘半小时，冷却称重到恒重（如两次称重相差在2mg以内，即作为恒重）。,2.麦芽渗出率测定（1）麦汁可溶性固形物的测定 密度瓶法a.将协定法麦芽汁混匀，立即灌入密度瓶中。将绝干的附温密度瓶用约10mL麦芽汁洗两次，然后灌满麦芽汁，装上温度计，并放置于水浴中（200.5），（如麦芽汁温度比较高，可先将麦芽汁放入冰箱中冷却后再做）保持水浴液面超过密度瓶颈刻度以上，在冰箱中恒温25min。b.取出密度瓶，调整麦芽汁使达到刻度，再待5min后准确的调整至恰好在刻度。将密度瓶取出外面擦干，用滤纸除去溢出侧
21、管的麦汁，立即盖上罩，放置5min，称量。计算相对密度，取5位小数。,C.从密度瓶计算浸出物。麦芽汁正确的浸出物量可由相对密度d从正式的糖度表附录查得B。折光锤度法。（2）结果计算麦芽浸出率的计算麦芽浸出物式中：M麦芽水分%B麦芽汁中可溶性固形物%,3.碘量法测定麦芽糖化力（1）操作步骤 麦芽糖化液的制备量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200 mL容量瓶中，加10 mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液，摇匀，在20水浴中保温20min。准确加入5.00 mL麦芽浸出液，摇匀，在20水浴中准确保温30min，立即加入1mol/L氢氧化钠溶液4 mL，振荡，以终止酶的活动，用水定容至刻度。空白试验的制备
22、量取2%可溶性淀粉溶液100mL，置于200mL容量瓶中，在20水浴中保温20min后，加入1mol/L氢氧化钠溶液2.35mL，摇匀，加5.00mL麦芽浸出液，用水定容至刻度。碘量法定糖吸取麦芽糖化液和空白试验液各50.00mL，分别置入250mL碘量瓶中，各加入0.1mol/L碘溶液25.00 mL，1mol/L氢氧化钠溶液3mL摇匀，盖好，静置15min。加1mol/L硫酸溶液4.5mL，立即用0.1mol/L硫代硫酸钠溶滴定至蓝色失为终点。,4 麦芽蛋白质（总氮）测定，（凯氏定氮法）（1）测定步骤 消化称取麦芽粉碎样约1.5g（精确到0.001g），移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，消化
23、。蒸馏本实验建议采用改良式微量定氮蒸馏装置，可下图安装进行蒸馏和吸收。蒸馏操作步骤如下：a.量取20mL 2%硼酸溶液于收集瓶（三角锥瓶）中，加混合指示剂23滴，接于游离氨馏出管A处，并使管口插入液面下（不宜太深）。b.打开开关1使冷水进入冷凝器部分。图8-2 改良式微量定氮蒸馏装置c.打开开关2使冷水进入蒸汽发生瓶内，当液面升至34厘米时将开关2关闭。,d.打开开关3，取消化稀释液5.00mL从漏斗处放入蒸馏瓶内，加入40%氢氧化钠8mL左右。再用少量蒸馏水洗净漏斗（少量多次），并使流入蒸馏瓶内。随即关闭开关3。e.加热蒸馏，待蒸馏约10分钟后（以蒸馏液沸腾时算起），将馏出管提出液面再蒸馏1
24、2分钟，直至氮全部馏出（可用红色石蕊试纸检查至馏出液不使石蕊试纸变蓝色为止）少量水洗涤馏出管处部，洗水一并当于上集瓶。滴定 用已标定的0.01mol/L盐酸标准溶液滴定收集之馏出液至灰色为终点。,残液排出与洗涤a.用洗耳球插入馏出管内将空气压入蒸馏瓶内，经开关4排出反复多次即可将残液排净。（或在蒸馏结束时立即打开开关2使冷水进入蒸汽发生瓶内产生真空将残液抽出）。b.打开开关3从漏斗注入冷水洗涤蒸馏瓶，关闭开关3，按上述手续反复多次即可洗净。c.打开开关2让冷却水进入蒸汽发生蒸内并同时打开开关4将水排出，待瓶洗净后关闭开关1、2并将洗水全部倒出后关闭开关4。,5.麦芽蛋白溶解度测定（1）步骤：分
25、别测麦芽总氮和麦汁可溶性氮，麦芽总氮按“4.”进行操作，麦汁可溶性氮的测定，吸取协定法麦芽汁25.00mL，置于500mL凯氏烧瓶中，其余步骤按“4.”进行操作。,6.茚三酮比色法测定氨基氮含量。（1）测定步骤 绘制标准曲线准确吸取200ug/mL的甘氨酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0mL（相当于0、100、300、400、500、600ug甘氨酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮显色剂1.00mL，混合均匀，于沸水浴中加热16min，取出迅速冷室温，加5.00mL碘酸钾稀释溶液，并加水至标线，摇匀。静置15mim后，于5
26、70nm波长下，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测定其余各溶液的吸光度，以标准氨基酸含量（ug）为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品测定吸取适量的协定法麦芽汁（使浓度为100300ug/mL 氨基酸），按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度，用吸光度在标准曲线上查得对应的氨基酸质量（ug）。,六、注意事项1.麦芽渗出液保存不应超过6h；2.麦芽糖化液的制备中，加氢氧化钠溶液后溶液应呈碱性，pH为9.410.6，可用pH试纸检验；3.本实验中用Na2S2O3标准溶液的制备、标定及注意问题参考分析化学有关部份。4.茚三酮与氨基酸反应非常灵敏，痕迹量的氨基酸也能给结果带来很
27、大误差，故操作中要十分注意，如容器必须仔细洗净，洗净后只能接触其外部表面。移液管不能用嘴吸等。5.茚三酮与氨基酸显色反应要求在pH6.7的条件下加热进行，果糖作为还原性发色剂，碘酸钾在稀溶液中使茚三酮保持氧化态，以阻止副反应。6.麦芽粉和麦芽汁消化液蒸馏时加碱量要充足，蒸馏装置不能漏气。,思考题1.试比较茚三酮比色法与甲醛滴定法定量氨基酸，各有什么优缺点？2.怎样测定麦芽汁密度？请自行设计方案。3.测定糖化力时，空白试验液的制备为什么要先加氢氧化钠后加麦芽浸出液？4.你对本实验有什么体会（包括成功的经验及失败的教训），简述影响实验结果的因素有哪些？,实验三、啤酒中双乙酰含量的测定,联二酮：系指
28、双乙酰和2.3-戊二酮的总称双乙酰：2.3一丁二酮。双乙酰是最主要的生青味物质，其含量越高，会导致啤酒口味不纯，有甜味直至馊饭味，在啤酒中味觉值根据啤酒的种类和品种的不同而不同。淡色酒下面发酵酒 一般为0.10.2ppm 上面发酵酒 一般为0.10.4ppm,2.3一戊二酮，在啤酒中的味觉值约为0.60.9ppm，一般对啤酒口味的影响不大，且在正常啤酒中双乙酰和2.3一戊二酮之比约3-6：1 联二酮在啤酒中 的 标准值为0.1mg/L 联二酮的含量是啤酒成熟的标志，随着主酵期和后酵期的缩短，双乙酰含量的测定越来越重要。,一.测定方法：1.比色法：2.色谱法：3.极谱法,1.比色法：1）原理：用
29、蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，与邻苯二胺反应，生成2，3一二甲基喹喔啉。2.3一二甲基喹喔啉的盐酸盐在335nm的波长下的吸光度，可作定量测量，由于其他联二酮类都具有相同的反应特征，因此测定结果为总联二酮含量。,2）仪器：紫外分光光度计 双乙酰蒸馏器（蛇形冷凝管）蒸汽发生器 移液管 容量瓶25ml 比色管50ml,3）试剂：*盐酸溶液：C（HCI）=4mol/L。取333ml浓盐酸，搅拌下注入约500ml水中，稀释至1000ml，摇匀，放置冷却。*邻苯二胺溶液：（1%）。溶250.0mg邻苯二胺于4mol/L盐酸中，用4mol/L盐酸稀释至25.00ml，使用当天配制，贮于暗处。*消泡剂：甘油
30、聚醚或有机硅消泡剂。,4）操作：*将安装好的双乙酰蒸馏器预热备用。*取25ml容量瓶接受馏出液，容量瓶内装少许蒸馏水，使馏出液管口能刚好浸在水下。容量瓶外加冰浴。*加1滴消泡剂与100ml量筒中，向量筒中注入100ml未经除气，预先冷至约5的酒样。*立即将酒样转移至双乙酰蒸馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞，加水密封。*加热蒸馏，直到馏出液接近25ml时取下容量瓶，达到室温后加水定容到25.00ml，摇匀（蒸馏需在35分钟内完成）。*分别吸取10.00ml馏出液置于两个比色管中，管1加0.50ml邻苯二胺溶液，管2不加，混匀，置暗处放置30min钟后取出。*管1加2.00ml4mol/L的盐酸溶液，管2加2.50ml4mol/L的盐酸溶液，混匀。*在335nm处，用2cm比色皿，以管2作参比溶液，测定吸光度。,5）计算：X=A3351.2式中：X试样中双乙酰含量mg/L A335试样在335nm波长下，用2cm比色皿测得的吸光度 1.2吸光度与双乙酰含量的换标系数结果表示至两位小数，同一样品平行测定值之差不应超过0.01mg/L。,1、记录数据2、绘制低温主发酵高温后熟工艺双乙酰浓度变化图,
