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1、实验一 质粒的提取和琼脂糖 凝胶电泳检测(高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克)实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,一、实验目的,了解高纯质粒小量制备试剂盒和碱法提取质粒的原理掌握百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法提取质粒的方法,二、实验原理(百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法)本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。一、原理简介本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。,实验原理
2、（碱法）,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,载体结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，
3、LacZ）独立的复制单位载体种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表达载体等,pBC SK map,三、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 恒温摇床 超净工作台 高压灭菌锅 高速台式离心机 微量取液器、1.5mLEP管 LB液体和固体培养基 卷纸、无水乙醇、双蒸水,（二）材料和试剂含pUM-T(pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5或HB101）。含外源基因的重组pUM-T(pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5或HB101）。氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成50-100 mg/ml 溶液，置-20
4、冰箱保存备用。,pMD18-T Vector,LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨 10g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g。加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。5.LB固体培养基（1L）：在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉(Agar)15g。,四、实验步骤 百泰克高纯质粒小量制备试剂盒,第一次使用前请先在15ml(25ml)漂洗液WB中加入45ml(75ml)无水乙醇!将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8保存。取毫升过夜培养的菌液，9000rpm，离心30秒，弃上清，
5、收集菌体，尽可能的倒干上清。处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。,2.用250 l溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和 纯度偏低。3.加250 l的溶液P2，温和的上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。,4.加400l溶液P3，立即温和的上下翻转6-10次，室温放置5分钟。室温13，000rpm离
6、心10分钟，小心取上清。5.(将吸附柱安置于收集管上，加入500l溶液P4，室温13,000rpm离心1分钟，弃滤液；)将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。,6.加入500 l去蛋白液PE，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用 菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1 Blue和DH5等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。加入500 l漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。重复步骤7一次，13,000r
7、pm离心30-60秒，弃滤液。空柱13,000rpm离心2 分钟。室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。,9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60-100 l洗脱缓冲液EB或双蒸水（洗脱缓冲液事先在65-70水浴中加热效果更好）,室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱质粒DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20保存。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应少于50l，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。,五、实验结果与讨论,1.实验结果2.讨论,附I：碱法提取质粒的原理和方法(一)试剂等 1.Solution
8、 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L EDTA(pH 8.0)高压灭菌后，4保存备用。2.Solution(现用现配制)0.2 mol/L NaOH 1%SDS,3.Solution（100 ml）：5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。4.胰RNA酶：将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷
9、却至室温，分装成小份保存于-20。5.氯仿，乙醇，70%乙醇。,（二）实验步骤,用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml）中，37振荡培养过夜。将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200L SolutionI 中,涡旋使充分悬浮。加入300L SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5 min。加入300L SolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5 min。,12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（
10、约600 L）。加入等体积氯仿（约600 L），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀 2030 min。12,000 rpm离心15 min。去上清，沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次（12,000 rpm离心3分钟）。,去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。每管中加入25L无菌水1L RNase，37溶解质粒DNA。,(三)实验结果及讨论,碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。,附II：B型质粒小样快速提取试剂盒北京博大泰克（BioDe
11、v）生物基因技术有限责任公司(一)概述 采用碱裂解-中和法，应用常规台式高速离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒DNA的上清通过设计独特的离心吸附柱式结构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离心吸附柱上洗脱下来。,(二)试剂盒组成及包装STE缓冲液(溶液1)Lysis Buffer(溶液2)3 M NaAc,PH 4.8(溶液3)结合缓冲液浓缩漂洗液洗脱缓冲液离心吸附柱废液收集管RNaseA(10mg/ml),(三)实验准备试剂盒使用前，在5 mL溶液1中加入300l RNaseA（RNaseA终浓度为0.6mg/mL）。溶液1使用完毕后，立即于4 保
12、存。浓缩漂洗液使用前按1：3的比例加入无水乙醇，例如15 mL浓缩漂洗液中加入45 mL无水乙醇，混匀后方可使用。实验前检查溶液2及结合缓冲液是否有高盐结晶。如有结晶，将盖拧松后加热10-15秒，高盐结晶溶解后再使用。,(四)实验操作步骤收集1.5-3mL 菌液的沉淀于1.5 mL Eppenforf离心管中，加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。加入150 l溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上1-2分钟（时间勿超！）。加入150 l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12，000rpm 离心12 分钟。,将420l结合缓冲液
13、加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12，000rpm 离心30秒钟。倒掉废液收集管中的废液。加入750 l漂洗液于离心吸附柱中，静置1分钟，12，000rpm 离心15秒。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后，再次于12，000rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗缓冲液。下心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5 mL Eppendorf离心管中，加入洗脱缓冲液，常规50l，室温放置2-5分钟，12，000rpm 离心1 分钟。,附III：H.Q.&.Q.高纯度质粒微量试剂盒（HP Plasmid Miniprep Kit）A样本制备 将带有
14、目的质粒的E.coli 接种于裝有5ml LB/氨苄青霉素(50g/ml)培养基的1020ml培养管中，37搖床培养1216 hr，以扩增质粒。建议使用endA 敏感型的E.coli 菌株来作常规质粒的分离，例如DH5 和JM109等菌株。,B操作方案1.取1.55ml的菌液，于室温下10,000g离心1min以沉淀菌种。2.倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250l的ZL-IRNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。3.往重悬混和液中加入250l ZL-II，轻轻翻转试管46次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。如有必要，可把裂解液置于室温
15、静置2min。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。当使用完ZL-II以后，须盖紧其瓶盖保存好。,4.往上述混和液中加入350l ZL-III，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10,000g离心10min。5.仔细 取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱裝在一个2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，并将其转置于柱子內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10,000g离心1min，使裂解液完全流过柱子。6.弃去离心甩出液，加入500l的ZL缓冲液到柱子上，室温下10,000g 离心1min，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的
16、高质量DNA。,7.弃去收集液，加入720l用乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子，室温10,000g离心1min，弃去洗涤液。注意：浓缩的DNA洗涤缓冲液在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。8.可选做步骤：重复步骤7，再用720l的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。9.室温下10,000g离心空柱1min以甩干柱子基质。注意：不要忽略此步这对从柱子上除去乙醇至关重要。,10.把柱子置于一干净的1.5ml小离心管中，直接加 入25l 灭菌去离子水或TE缓冲液液到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），10,000g离心1min以洗脱出DNA。这样，可得到大约7580的结合DNA，若进行第二次洗脱则可得到大部分残余的DNA，只是浓度较低。,
