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1、实验四 T-A连接（克隆）,赵建军 张龚炜,一、实验目的,学习和掌握DNA连接的原理和方法理解T-A连接的优缺点理解蓝白斑筛选的原理和方法,二、实验原理,DNA连接反应（transformation）利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子。载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。T-载体：聚合酶链反应（PCR）产物的克隆载体，两侧3端各多出一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)。由于PCR产物两侧3端通常含单个脱氧腺嘌呤核苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆
2、的效率。,二、实验原理,二、实验原理,自制T载体：XcmI:5-CCANNNNNNNNNTGG-3,二、实验原理,一些载体（如PUC系列质粒）带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端片段146个氨基酸的编码信息。该编码区中含有多克隆位点，可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码lacZ C端片段的突变宿主细胞。因此，虽然宿主和质粒编码的片段都没有lacZ活性，但它们同时存在时，片段与片段可通过-互补形成具有酶活性的-半乳糖苷酶。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。,二、实验原理,而当外源DNA插入到质粒的多
3、克隆位点后，几乎不可避免地破坏片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。,三、T-A连接（克隆）的材料,三、T-A连接（克隆）的材料,材料：特定的感受态大肠杆菌（DH5a、DH5b、Top10、Bl21等）PCR 试剂、DNA纯化试剂盒、T载体、DNA连接酶、X-Gal、IPTG。LB平板（Amp抗性）：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂1.5%，0.5mg/ml Amp。,三、T-A连接（克隆）的材料,四、T-A连接（克隆）的过程,1.克隆DNA片段的准备：PCR反应,四、T-A连接（克隆）的过程,PCR产物纯化：离心柱法结合：
4、加入5倍体积的结合液，混合；过柱：将PCR产物-结合液混合物加入离心柱，12000 rpm 离心1min，弃收集液；漂洗：向离心柱中加入600ul漂洗液，12000 rpm 离心1min，弃收集液，重复一次，12000 rpm 离心3min；洗脱：离心柱套入一个1.5ml EP管，向离心柱加入20ul 超纯水，停留2min，12000 rpm 离心1min，将收集液返回离心柱，重复离心3min,保留收集液（纯化DNA产物）备用。,1.克隆DNA片段的准备：PCR产物纯化,四、T-A连接（克隆）的过程,2.T-A连接：PCR产物-T载体连接16-24连接2-10h,四、T-A连接（克隆）的过程,3.连接产物转化大肠杆菌并通过蓝白斑筛选和抗性筛选阳性克隆。IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)40ul X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)40ul转化菌液 40ul混合涂板，37培养过夜（16h以上）。,谢谢！,
