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1、生物化学与分子生物学基础实验,实验一 几种蛋白质定量测定方法的比较,生物化学与分子生物学基础实验,1 掌握紫外吸收法、Folin酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法2 掌握分光光度计的原理和使用方法,实验目的,生物化学与分子生物学基础实验,有多少样品可供分析;蛋白质样品浓度大约是多少;样品中含有哪些可能影响定量的化学物质；所选方法是否简单、可靠；含量测定的专一性要求是否很高。,选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：,生物化学与分子生物学基础实验,常用的方法,物理性质：紫外吸收法化学性质：Folin酚试剂法（Lowry法），BCA法（
2、Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16）。,生物化学与分子生物学基础实验,蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。,280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质
3、，其280nm的吸收值差别很大(图1)。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱图A是15g/ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01%Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。图B是10g/ml RNA和DNA的吸收光谱。,生物化学与分子生物学基础实验,肽键在190nm有强吸收峰。一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm波长，Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,and Arg
4、的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。缺点:干扰因素多。许多化学物质特别是含CC双键和CO双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,优点：不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；测量极其简单迅速；蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,缺点：干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收,所以一定要考虑样品中是否有核酸.要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。敏感度低，要求样品的浓
5、度较高，量较大。用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,操作步骤,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,考马斯亮蓝染色法（Bradford法）,原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。25min呈最大光吸收，至少可稳定1小时,生物化学与分子生物学基础实验,简便,迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂影响因素较少
6、。去污剂和两性物质对测定有干扰小于3000Da 的多肽无法测定蛋白浓度高时非线性配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250,考马斯亮蓝染色法（Bradford法）,生物化学与分子生物学基础实验,实验操作步骤,室温放置5分钟后测595nm的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。,考马斯亮蓝染色法（Bradford法）,生物化学与分子生物学基础实验,原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组成。试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原成Cu+。Cu+以及蛋白质中的Tyr等的侧链基团与试剂乙反应，试剂
7、乙中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和Phe残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合物），显色反应在30分钟内接近极限。颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。,Folin-酚试剂法（Lowry法）,生物化学与分子生物学基础实验,酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试剂乙加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还原
8、反应即能发生。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。费时较长，试剂配制较繁琐。,Folin-酚试剂法（Lowry法）,生物化学与分子生物学基础实验,实验步骤,Folin-酚试剂法（Lowry法）,生物化学与分子生物学基础实验,试剂、实验材料：（已放在每个试验台的架子上）,标准蛋白溶液：1mg/ml BSA未知蛋白溶液考马斯亮蓝染色液Folin-酚试剂甲Folin-酚试剂乙,生物化学与分子生物学基础实验,Lowry 法的改进法。碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并将Cu2+还原成Cu+；Cu+与BCA结合成紫
9、色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈正比,BCA法,生物化学与分子生物学基础实验,与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。可耐受高达5%的表面活性剂测定不同蛋白样品时比bradford测定法结果均一,BCA法,生物化学与分子生物学基础实验,常用的测定蛋白质含量方法的比较,生物化学与分子生物学基础实验,1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。2、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前
10、，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出的样品浓度与实际的浓度不符。,注 意,生物化学与分子生物学基础实验,722型光栅分光光度计,光源,单色器,样品池,光电源件,读数单元,测量完毕，请把光度计的盖打开！,讲解完毕后，每个组出一个同学去127听老师讲解仪器使用。,生物化学与分子生物学基础实验,TU1800 紫外可见分光光度计,波长范围：2001100nm测光系统：单光束,功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量,钨灯：3401100nm氘灯：200340nm,生物化学与
11、分子生物学基础实验,1 测紫外吸收要用石英比色皿！2 定量实验取液要准确。3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润洗。因此3ml溶液足够测定。4 测量完毕，请把光度计的盖打开！5 每次实验时提交上一次的实验报告。,注意事项,生物化学与分子生物学基础实验,实验报告,原始数据需老师签字，附在实验报告上。真实记录实验数据，以标准蛋白含量为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并标出未知溶液的蛋白含量。可以进行各种软件绘图。单位、标示要清楚,生物化学与分子生物学基础实验,微量移液枪使用注意事项,轻拿轻放，不能摔、砸。严禁将量程调出标准使用范围。使用过程中携带有Tip头的移液枪不可以倒过来(特别是里面还有液体的时候)，以防液体流入枪内，腐蚀部件。不用移液枪时不要一直拿在手里，应挂于枪架上。每日实验结束后，应将移液枪量程调至最大，长期压紧弹簧会影响准确度。,5ml 白色Tip头回收！废Tip头放入废物烧杯中！污染问题！安全问题！,生物化学与分子生物学基础实验,实验二 葡聚糖凝胶柱层析,实验分两拨：前两个实验台的同学下个星期来做实验；后两个试验台的同学下下个星期做,
