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1、第五章 真核生物的遗传分析,真核生物遗传物质在细胞核中，染色体由DNA和蛋白质等物质组成。通常一个基因组包含若干个染色体，具有多个复制起点，含有大量重复序列和不编码序列。功能相关的基因可以位于不同的染色体，没有明显的操纵子结构，但存在不同类型的基因家族。真核生物基因组同样呈现不固定性，不仅有基因丢失、扩增和重排，而且转座成分首先也是在真核生物中发现的。,第一节 真核生物基因组,一、基因组与 C值 基因组：一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组。C值：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对含量是恒定的，通常称为该物种DNA的C值。不同物种C值差异很大。,从原核生物到真核
2、生物。其基因组大小和DNA含量是随生物进化复杂程度的增加稳步上升的。随生物结构和功能复杂程度的增加，需要的基因产物越多，所以C值就越大。最小的C值:支原体(106bp),最大的C值:某些显花植物和两栖动物(1011bp),C值悖理：C值大小不能完全说明生物进化和遗传复杂性的高低，即物种的C值和他进化复杂性之间没有严格的对应性，这种现象称C值悖理。C值悖理现象使人们认识到真核生物基因组中比如存在大量不编码的DNA序列。一般而言，越是简单的生物，基因组中不编码蛋白质的DNA序列越少。它们的结构基因的数目越接近于相应DNA含量所估计的基因数。,二、真核生物基因组的结构特点：,真核生物基因组大部分位于
3、细胞核中，一般由多条染色体组成，每条染色体又是由DNA分子与蛋白质稳定地结合成染色质的多级结构。每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在着不表达的插入序列，即内含子。功能上密切相关的基因集中程度不如原核生物，在真核生物中尚未见到有关操纵子的报道。,C.存在大量不编码蛋白质的DNA序列，果蝇的基因数约为5000个，占基因组DNA序列的10左右，人的基因数推测为50000个，约占基因组DNA序列的1。D.真核生物的蛋白质编码基因往往位于基因组DNA单拷贝序列中，除单拷贝序列外还存在大量重复序列（repeat sequence），重复序列的拷贝数可高达百万份以上，在人的基因组中，至少具有2
4、0份拷贝的DNA，占总DNA的30左右。,E.真核生物基因组中，有许多结构相似、功能相关的基因组成所谓的基因家族（gene families）。F.真核生物除了主要的核基因组外，还有细胞器基因组，而且细胞器基因组对生命是必须的，不像原核生物质粒DNA基因对细菌生存不是必须的。,真核生物基因组DNA序列的复杂度,一、重复序列的检测 通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。推导出C/C0=1/（1+k C0 t)其中C为单链DNA的浓度，t为时间（单位为s），k 为重组速率常数（单位是Lmols），C0是DNA总浓度。当t=0时，C=C0，表明所有DNA都是单链。,C0 t曲线：C/C0是起
5、始浓度和经过时间的乘积C0 t的函数，这样的函数绘制的图称。若当t=t1/2时，即C/C0=1/2时，也就是50%单链复性时，则上式方程式为C0 t1/2=1/k。若基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝，则基因组愈大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小，k愈小，则C0 t1/2愈大，所以C0 t1/2与非重复序列的基因组大小成正比。即：基因组A的C0 t1/2 基因组B的C0 t1/2 基因组A的核苷酸对数 基因组B的核苷酸对数,=,二、DNA序列的类别（一）单拷贝序列（unique sequence)：非重复序列，在一个基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝。真核生物大多数基因在单倍体中都是单
6、拷贝的。动物细胞基因组中将近一半DNA是中度或高度重复的，特别是植物和两栖类生物中单拷贝DNA序列降低，而中度和高度重复序列增加。,（二）中度重复序列（moderately repetitive sequence)：重复单位长度约300bp，重复次数为10102，人的珠蛋白基因属于这种少量重复序列。另一类中度重复序列的重复次数为103 105，该序列常以回文序列方式出现在基因组的许多位置上，一些回文序列中间间隔着单拷贝序列，另一些中间不存在单拷贝序列，因此经过变性复性后，前者可看到茎-环结构，后者可形成发夹结构。P116图6-6,（三）高度重复序列（high repetitive sequen
7、ce)，一般重复次数在106以上，通常这些序列长度为6-200bp，如卫星DNA。大多集中在异染色质区，特别在着丝粒和端粒附近。常带有一些AT含量很高的简单串联重复序列。因序列简单，缺乏转录所必须的启动子，故无转录能力。但复制能力却和单一序列一样快。,三、卫星DNA（satellite DNA）概念：对一个物种来说，当基因DNA切断成数百个碱基的片段进行超速离心时，其浮力密度曲线是覆盖一定浮力密度范围的，但有些DNA片段都含有异常高或异常低的GC含量，常在主要DNA带的前面或后面有一个次要的DNA带相伴随，这些小的区带就象卫星一样围绕着DNA主带，称卫星DNA。,高度重复顺序的功能,1.调节反
8、向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）与DNA的结合位点2.参与基因表达的调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用,3.参与转位作用 几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp 到1400bp，形成回文结构，在转位作用中既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。,4.与进化有关 不同种属的高度重复顺序，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如：人与非洲绿猴的卫星 DNA长度仅差1个碱基（前者为171 bp，后者为172bp），而且碱基序列有65
9、是相同的，表明它们来自共同的祖先,5.同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹6.卫星 DNA 成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序,第二节 真菌类的遗传分析,红色面包霉的特点易于繁殖、培养、管理；可直接观察基因表现，无需测交；可获得、分析单次减数分裂的结果；等。红色面包霉减数分裂特点：每次减数分裂结果(四个分生孢子，或其有丝分裂产生的八个子囊孢子)都保存在一个子囊中；四分子或八分子在子囊中呈直线排列直列四分子，直列八分子，具有严格的顺序。,一、顺序四分
10、子及其遗传分析,四分子分析(tetrad analysis)：红色面包霉减数分裂的4个产物保留在一起，称四分子，对四分子表现进行的遗传分析，称为四分子分析。,四分子分析的优越性：1、可把着丝粒看作一个座位2、子囊孢子的对称性，证明减数分裂是一个交互过程。3、可以检验染色单体的交换是否有干涉，还可用于基因转变的研究。4、证明双交换可以包括4线中的两线、3线或4线。（一）染色体作图（centromere mapping)：利用四分子分析法，测定基因与着丝粒间的距离。染色体作图的依据：在非姐妹染色单体间没有发生着丝粒和基因间交换的减数分裂，称第一次分裂分离（first-division segreg
11、ation)或叫M1模式分离。P118 若发生了交换，称第二次分裂分离（second-division segregation)或称M2模式分离。P118,例：红色面包霉的连锁与交换,红色面包霉有一个与赖氨酸合成有关的基因(lys)：野生型能够合成赖氨酸，记为lys+，能在基本培养基(不含赖氨酸)上正常生长，成熟子囊孢子呈黑色；突变型不能合成赖氨酸，称为赖氨酸缺陷型，记为lys-，在基本培养基上生长缓慢，子囊孢子成熟较迟，呈灰色。用不同接合型的lys+和lys-杂交，可预期八个孢子中lys+和lys-呈4:4的比例，事实也是如此。在对子囊进行镜检时发现孢子中lys+和lys-有六种排列方式，即
12、我们教材p80表3-7所示的六种排列方式。,六种子囊孢子排列方式,六种子囊孢子排列方式,第一次分裂分离与第二次分裂分离,(1-2)两种排列方式：野生型lys+和突变型lys-在 M1彼此分离，称第一次分裂分离(first division segregation)。着丝粒和lys基因位点间不发生非姊妹染色单体交换，因此这两种子囊类型就是非交换型子囊。,(3-6)四种排列方式：第一分裂产物中野生型与突变型未发生分离，野生型和突变型 M2发生分离，称第二次分裂分离(second division segregation)。着丝粒与基因位点间发生非姊妹染色单体交换，因此这四种子囊均为交换型子囊。,非
13、交换型、交换型子囊的形成,着丝点距离与着丝点作图,将着丝点当作一个基因位点看待，计算基因位点与着丝点间的交换值，估计基因与着丝点间的遗传距离，称为着丝点距离。每个交换型子囊中，基因位点与着丝粒间发生一次交换，其中半数孢子是重组型(重组型配子)。因此，交换值（重组率RF）的计算公式为：M1/2RF=100%M+MRF 0-lys=(9+5+10+16)1/2/(105+129+9+5+10+16)100%=7.3%即着丝粒与 lys 间的距离为7.3cM。,（二）两个连锁基因的作图,粗糙链孢酶有两个突变型：烟酸依赖型(nic)-需在培养基中添加烟酸才能生长腺嘌呤依赖型(ade)-需在培养基中添加
14、腺嘌呤才能生长 nic+ade,必有6 6=36种不同的子囊型，但若把着丝粒在减数分裂中的随机趋向造成的不同归为一类，可归纳为7种基本子囊型。如只考虑性状组合，不考虑孢子排列顺序，还可把子囊分为3种类型：,1、亲二型（parental ditype PD)，2种基因型，都为亲型，包括和2、非亲二型（non-parental ditype，NPD)：2种基因型,都为重组型，包括和。3、四型（tetratype,T)：4种基因型，2亲本2重组，包括、和,1、判断nic和ade是独立分配还是连锁：若独立分配，则PD：NPD=1或1 若连锁，则PD：NPD 1 实际上：PD：NPD1，所以两基因连锁。
15、2、计算着丝粒和两基因间的RF：RF（0-nic)=(M1/2)/(M+M)100%=1/2(5+90+1+5)/1000 100%=5.05%;图距=5.05cM RF（0-ade)=(M1/2)/(M+M)100%=1/2(90+90+1+5)/1000 100%=9.3%;图距=9.3cM根据RF值可知两基因在染色体上有两种可能排列方式：nic ade nic ade 5.05 9.3 5.05,9.3,3、判定两基因在染色体的同臂还是异臂上：估算两基因的RF值：RF（nic-ade)=重组型/（亲本型+重组型）100%=（1/2T+NPD）/（T+PD+NPD）100%=1/2（90+
16、5+5）+（1+1）/1000 100%=5.2%，图距=5.2cM 0 nic ade 5.05 5.2 10.25,利用两连锁都处在M时的PD和NPD四分子类型出现的频率来判断它们处在同臂还是异臂上：,若两连锁基因在异臂上，则PD与NPD都由双交换形成且机会相等，所以PD=NPD。但事实上PDNPD故此情况不可能 nic和ade在同臂上 已知RF（0-nic)+RF（nic-ade)=5.05%+5.2%RF（0-ade)=9.3%即RF（0-nic)+RF（nic-ade)RF（0-ade)原因：着丝粒和ade间发生过双交换，但在计算 RF（0-ade)时却没有计算在内，而在计算RF（0
17、-nic)和 RF（nic-ade)时都各计算一次。,校正着丝粒与 ade间的重组值,由上表可以看出202+208 372，低估的重组值=（202+208-372）/4000 100%=0.95%RF（0-nic)+RF（nic-ade)=RF（0-ade)+0.95%=9.3%+0.95%=10.25%,1、携带基因a的链孢霉品系与携带基因b的品系杂交，结果如下：（1）a+a+b+b 78%（2）a+ab+b 15%（3）a+a b+b 6%（4）a+b a+b 1%问：（1）a和b与着丝点的重组值是多少？（2）a与b连锁吗？若连锁请绘出a、b及着丝点的遗传图。,一、同源重组 1.同源重组（
18、交换）：两个染色体或DNA分 子相互交换对等部分的过程。例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、结合；噬菌体的重组 2.条件：2个DNA分子序列同源（相同或相近），且同源区域越长越有利。3.功能：A：维持种群的遗传多样性；B：有助于DNA的损伤修复；C：使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。,第三节 真核生物重组的分子机制,同源重组中负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列的特异性。对于真核生物来说，染色质状态对重组也有影响，如异染色质及其附近区域很少发生重组。而大肠杆菌的同源重组需要RecA 蛋白质的参与。,二、同源重组的分子机制,（一）重组双
19、方DNA分子的断裂与重接 1.证据：1961，M.Meselson and 两个双标记噬菌体感染大肠杆菌。(c.mi)噬菌体1 13C和14N“重”链(+.+)噬菌体2 12C和14N“轻”链,同时感染,大肠杆菌,子代噬菌体,CsCl密度梯度离心,重链重链和轻链轻链,2、几个概念：重组核心：两个DNA分子的连接 连接分子/接合分子 重组连接点/重组结合点 杂种DNA/异源双链DNA区,二、同源重组的Holliday模型(如图）Robin Holliday于1964年提出了重组的杂合DNA模型，又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下：A、同源的非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色
20、单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；C：切开的单链交换重接;D：形成交联桥结构；,E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）F：E和F相同；G：绕交联桥旋转1800；H：形成Holliday异构体；I、通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。由上可知：无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，它们都含有一个异源双链DNA区。,第四节 基因转变及其分子机制（一）异常分离与基因转变 遗传重组导致异源双链DNA片段的形成，即异源双链DNA含有错配
21、碱基序列，由此解开基因间重组特性，而等位基因重组又为异源双链模型的发展提供了证据。子囊菌类可用来研究等位基因重组事件。,1.基因转变（1938，H.Vinkle），一个基因转变为它的等位基因。pdxp：酸度敏感的VB6需要型 pdx：酸度不敏感的VB6需要型,2.Mitchell：+pdxp x pdx+,3.基因转变：子囊菌等容易研究，子囊孢子颜色，粗糙链孢霉、粪生粪壳菌、面包酵母 共转变：一个基因内部不同突变位点同时发生 基因转变的现象 极化子：染色体基因转变频率呈现从一端向另一端递减的极性现象的小区。4.粪生粪壳菌 g+（黑）x g-（灰）,（二）基因转变的类型 染色单体转变：6：2分离
22、比 减数分裂4个产物中，一个出现基因转变 半染色单体转变：5：3；3：1：1：3 减数分裂四个产物中，一个或2个的一半出现 减数分裂后分离：等位基因的分离发生在减数分裂后的有丝分裂中。,（三）、基因转变的分子机制,第三节 基因家族,一、基因家族的类型和Alu家族基因家族：真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族（gene family)。根据基因家族的复杂程度，可将其分为3种类型：A：简单的多基因家族；B：复杂的多基因家族；C：不同场合表达的复杂多基因家族。（P174图7-7）Alu家族：一类长度相似、性质相似的重复序列，称为Alu家族。,二、基因
23、簇和假基因基因簇：一个基因家族的成员紧密连锁成蔟状排列在某一染色体，构成一个基因簇（gene cluster)。假基因：在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，但在结构和DNA序列上与有功能的基因具有相似性，这种成员称为。,真核生物基因结构示意图,第五节 真核生物基因的丢失、扩增与重排,基因丢失概念:一些低等真核生物如原生动物、线虫、昆虫等的发育中，许多体细胞常丢失一些基因或染色体，以消除这些基因的活性。只有要发育成性细胞的那些细胞保留完整的基因组。这种现象称。如马蛔虫和小麦瘿蚊等。根据研究，调控染色体丢失的主要物质是核酸。细胞的全能性：高等生物很多生物的不同类型细胞常有发育成完整个
24、体的潜在能力，即具有个体发育所必须的全部基因，这种能力称为。,不育瘿蚊,基因扩增 基因扩增(gene amplification)是指基因组内某些基因的拷贝数专一地大量增加的现象。它 是细胞在短期内为满足发育或生理适应的需要而产生足够多的基因产物的一种调控手段，它的实质是通过差别的基因复制(differential gene replication)而完成的。如两栖类和昆虫的卵母细胞rRNA基因(rDNA)的扩增，由于卵母细胞成长过程中需要合成大量的蛋白质以满足它在受精后发育的需要这就需要卵母细胞中积累大量的核糖体，为此首先必须合成大量的rRNA。,基因重排 基因重排(gene rearran
25、gement)是指DNA分子核苷酸序列的重新排列，不仅可形成新的基因，还可调节基因的表达。如哺乳动物免疫球蛋白基因就是通过个编码区的重排而形成的。,第六节 遗传标记,遗传标记：可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。常用基因的连锁分析、基因定位、遗传作图和基因转移的鉴定。因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。,类型：形态标记（morphological marker）细胞学标记(cytological marker)生化标记(biochemical marker)分子标记(molecular marker
26、),一、形态标记 即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。,二、细胞学标记 即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记
27、材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。,三、生化标记 主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没
28、有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。,四、分子标记（DNA标记）在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：,（1）是以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP），这类分子标记被称为第一代分子标记。（2）是以PCR技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标记被称为第二代分子标记；单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记。它也是以PCR技术为基础的分子标
29、记技术。,几种主要的分子标记,几种主要的分子标记,（一）RFLP标记：称为限制性片段长度多态性，是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。,RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。,特点A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。B RFLP
30、标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰,D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。,(二)、AFLP标记 AFLP：即扩增片段长度多态性DNA（amplified fragment polymorphism DNA)，指基因组DNA经酶切后形成的限制性片段，在PCR引物识别下进行PCR扩增反应，然后直接进行电泳分离和染色，由扩增产物所显示出来的多态性。此法
31、既具有RFLP的优点如稳定性好、不受基因互作和环境条件影响，带纹丰富等特点，又具有PCR的用量少，灵敏度高、快速高效的功能优点，是一种理想的分子标记。,PCR（polymerase chain reaction)：聚合酶链式反应的简称。它是利用DNA复制过程的一种模拟。其基本方法是试管内用一对与目的片段两侧两条链互补的引物，在DNA聚合酶的作用下引发某段特异DNA进行反复复制，使之迅速扩增，便于进一步分析研究。,(三)、RAPD标记 williams等人(1990)首次运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法 命名为随机扩增多态DNA(random ampilfid polymorphism DNA，RAPD)。实际上RAPD是一种特殊形式的AFLP，它与一般的AFLP的最大区别是用于扩增多态性DNA引物不是专一的而是随机的。,RAPD标记是建立于PCR技术基础上的，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过电泳、染色来检测扩增产物DNA的多态性，这些产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。,
