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1、,系列实验 液体通气发酵谷氨酸发酵,实验目的,谷氨酸(Glutamic acid)是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸，谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，因此，了解谷氨酸发酵机理，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其它有氧发酵，特别是氨基酸发酵的理解和掌握。,谷氨酸发酵生理,谷氨酸发酵包括了谷氨酸的生物合成和产物的结累二个过程,EMP和HMP TCA循环 DCA循环 CO2的固定 氨的导入,谷氨酸的生物合成途径,实验室谷氨酸发酵,一、谷氨酸菌种的制备,培养基 培养基可直接用营养琼脂，称取一定量的营养琼脂，加热溶解，分装到试管中，不能超过试管体积的1/3。灭菌 将装有琼脂培养
2、基的试管高压灭菌锅里面 121，高压灭菌20分钟。接种 试管倾斜放置等斜面凝固 超净台 开启三十分钟后，通风5分钟后方可进行操作。从冷冻的菌体中用接种针挑取一定的菌种，Z 字型接种到试管斜面上。,注意事项 菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产酸下降，严重的不积累产物，因此，在菌种制备的整个过程中，都要树立起牢固的无菌概念，工作力求细致、到位,一、谷氨酸菌种的制备,培养将试管放入28度 恒温培养箱中培养，每天注意观察记录。扩大培养 斜面生长大约三天左右。菌种开始长出，然后接种到250ml锥形瓶液体培养基中，28 150转 摇床培养。,二、发酵罐构造的熟悉及空气管路的灭菌,谷氨酸发酵是有氧发酵，
3、发酵罐由空气管道、蒸汽管道、水管道和排污管道等组成。,1.方法：蒸汽灭菌法，事先打开蒸汽发生器 蒸汽发生器使用注意：使用时保持进水；一般保持“自动”位置2.调节压力0.11Mpa，并保压30分钟，在此过程中，时刻注意观察此压力。3.空气过滤器的吹干：事先打开空气压缩机；空气管道灭菌时间到后，关上排污阀，打开空气阀，送入空气吹干过滤器，约需2025分钟。,三、发酵罐的空消,控制压力0.110.12MPa，保压30分钟；空消结束后，打开空气，保压0.030.05MPa之间。,一般地，空气管路可以与发酵罐一起灭菌。,四、发酵培养基的配制按工艺要求配制培养基（课本P88）和40%的尿素。培养基体积：理
4、论容积：按发酵罐容积的70%来定容；实际定容：按照预定体积的75%来定容，余下的25%留 给蒸汽冷凝水和种子液。放入pH、OD电极（注意事先要校对）空消后待罐温度降低，手摸玻璃视窗不烫手，才可倒入培养基。否则冷热刺激，玻璃会破裂。,五、实消（1）先打开进夹套的蒸汽阀和夹套下排水，开启搅动，待温度上升到90度时，关闭夹套进汽阀，打开进发酵罐的蒸汽阀，继续升温到实验要求。（2）保压0.11MPa，105保持5分钟。（3）时间到后，关闭进气阀，打开冷却水进行冷却；注意保持罐压0.030.05MPa（4）温度降至40度左右时，加初尿，添加量为0.61%,六、接种,缓慢降罐压至0.01MPa火焰封口法接
5、种,七、发酵过程的控制（1）长菌期：0 12小时，最适温度3032度，控制pH不大于8.2。（2）产酸期：12小时后，控制温度3436度，控制pH在7.17.2。,八、放罐,谷氨酸的等电回收发酵罐的清洗,系列实验液体静止发酵啤酒发酵,实验目的,通过啤酒的实验室发酵试验，熟悉无氧发酵工艺的大致过程，了解啤酒的酿造特点，从而增强对啤酒发酵的感性认识，为有志于啤酒生产与科研的同学打下基础。,啤酒发酵概述,啤酒是一种以麦芽汁为原料，经酵母菌发酵酿制而成的含酒精饮料。,啤酒发酵生理学,啤酒的化学组成啤酒发酵过程,一、啤酒的化学组成,啤酒中所含的成分很多，除水外，还有其它近600种成分，其中主要有：1、酒
6、精2、浸出物3、二氧化碳4、挥发性成分,二、啤酒发酵过程,酵母菌是一种兼性厌氧微生物，有氧时进行呼吸作用，糖的消耗缓慢，酒精的产量很低，这种呼吸抑制发酵的现象，称为巴斯德效应（Pasteur effect）。但在有氧条件下，如果含糖含量过多（葡萄糖浓度超过4g/L时）又会使呼吸受抑，从而促使发酵的进行，这种现象称为克拉勃脱效应（Crabtree effect），又称反巴斯德效应。,啤酒发酵过程中，酵母主要通过EMP途径进行酒精发酵，生成大量乙醇，CO2和微量乳酸，但也有少量糖(约占46)通过HMP途径，合成NADPH 以及戊糖原料。,三、啤酒发酵的原料,啤酒发酵的主要原料是麦芽汁，是由麦芽经粉
7、碎后兑水糖化而成。为了降低成本，大多数厂家都会适当添加一些辅助原料。另外，为了保证啤酒的品质和口味，麦汁中必须添加一定浓度的酒花。1.水 2.麦芽：大麦经浸麦、发芽、烘干、焙焦而成 3.辅料：采用富含淀粉的谷类、糖类或糖浆作为辅助原 料 4.酒花：利用其苦味、香味、防腐力和澄清麦汁的能力,四、麦汁的制备,主要过程：（1）麦芽和谷物的粉碎；（2）糖化制成麦芽汁；（3）过滤分离麦糟；（4）麦汁煮沸并添加酒花；（5）麦汁预冷却和冷却。,1.麦芽粉碎,目的：使表皮破裂，增加麦芽本身的表面积，使其内容物质更容易溶解，利于糖化。要求：表皮的破碎要破而不碎。因为表皮的主要组成是各种纤维组织，其中有很多物质会
8、影响啤酒的口味，如果将其粉碎，在糖化过程中，会使其更容易溶解，从而影响啤酒的口味；其次在糖化后的过滤中，可以让其充当过滤层，达到更好的过滤效果。,2.糖化制成麦汁,糖化：利用麦芽所含的各种水解酶，在适宜的条件下，将麦芽中不溶性高分子物质（淀粉、蛋白质、半纤维及其中间分解产物），逐步分解成低分子可溶性物质的过程。过程包括：淀粉分解、蛋白质分解、B-葡聚糖分解、酸的形成和多酚物质的变化。,3.麦汁过滤,目的：糖化结束后，应在最短的时间内，将糖化醪液中的原料溶出物和非溶性的麦槽分离，以得到澄清的麦汁和良好的浸出物收得率。,4.麦汁煮沸,过滤后的麦汁需进行煮沸并添加酒花。其目的是：A、蒸发多余水分，使
9、麦汁浓缩到规定浓度。B、使酒花有效成分溶入麦汁中，赋予麦汁独特的香气和爽口的苦味，提高麦汁的生物和非生物稳定性。C、使麦汁中可凝固性蛋白质凝固析出，以提高啤酒的非生物稳定性。D、使酶失活，主要是停止淀粉酶的作用，以获得定型的麦汁。E、对麦汁进行灭菌，消灭麦汁中的各种菌类，特别是乳酸菌。,5.麦汁预冷却和冷却 预冷却：分离煮沸过程中产生的热凝固物。回旋沉淀槽是最常用的预冷却方法。冷却：通过麦汁冷却器，迅速冷却至发酵所需的温度，同时析出冷凝固物（指温度在70以上为溶解状态，但降至70以下开始析出的物质）的过程。,五、啤酒发酵工艺,冷却后的麦汁添加酵母后，便是发酵的开始。啤酒发酵中麦汁中的可发酵糖等
10、营养物被酵母细胞中的酶分解成酒精和二氧化碳，并产生诸如双乙酰、高级醇、醛、酸、酯和硫化物等一系列风味活性物质，将麦汁的风味转变成啤酒风味。,前发酵：一般将发酵液温度控制在910左右，发酵7l0天即成嫩啤酒。后发酵：嫩啤酒输贮酒罐中进行后发酵（又称贮酒），一般在03下贮酒4290天，以达到啤酒成熟、二氧化碳饱和和啤酒澄清的目的。,实验室啤酒发酵,目的：熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒）。,实验步骤：,啤酒酵母扩大培养培养基的配置啤酒酵母的培养基选用麦芽汁培养基，具体方法为：称取麦芽粉，比例为4g麦芽粉对
11、应10ml麦芽汁，保证麦芽汁浓度在812。将麦芽粉和水混匀，在电炉上加热至 70保持半小时左右。静置取上清液，加入2%琼脂粉，加热煮沸，搅拌均匀。灭菌将培养基液分装入 若干个试管中，注意不能超过试管体积的三分之一，然后用绵花塞住。放入高压灭菌锅 121、20分钟灭菌处理。,接种 将灭菌好的试管培养基倾斜放置，等斜面凝固。超净台 开启三十分钟后，通风5分钟后方可进行操作。从冷冻的菌体中用接种针取一定的菌种 Z 字型涂到试管斜面上。培养 将试管 放入28度 恒温培养箱中培养，每天注意观察记录。扩大培养 斜面生长大约三天左右。菌种开始长出，然后接种到盛有麦芽汁液体培养基的锥形瓶中，28度左右培养。,
12、啤酒酵母扩大培养,（5）麦汁煮沸：夹套中通蒸汽加热升温到100，并保温30min，此过程称取20克酒花粉碎后加入到煮沸锅中。（6）麦汁预冷却 煮沸的麦汁泵入回旋沉淀槽。（7）麦汁冷却（提前打开冰水罐）将预冷的麦芽汁通过薄板冷却器进行冷却,4.接种,5.发酵,将冷却的麦芽汁输入到发酵罐（提前打开预冷到10）中。接种：火焰封口法,前发酵后发酵每天注意观察温度、压力等注意要控制压力小于0.1（0.05MPa），否则要排气，排气动作要缓。,系列实验红曲菌固体发酵,系列实验目的,通过红曲的制作，了解固体发酵的大致过程，并学习从红曲培养物中提取红色素及其它生理活性物质的方法。,红曲菌固体发酵概述,一、红曲
13、霉的形态及分类隶属于真菌界 子囊菌门 子囊菌纲(Ascomycetes)散囊菌目(Plectascales)红曲菌科(Eurotiascus)红曲霉属(Monascus)，,二、红曲霉的生理特性,在合成培养基（葡萄糖5，NaNO3 1，KH2PO4 0.5，MgS04 7H2O 0.25，FeCl3 微量）中，红曲霉菌株的生长最适温度是30-35，25以下或40以上生长缓慢。最适pH为，pH3.0以下生长缓慢，pH5.0以上则不适于产生色素。,红曲霉能产生醇、酯、酸等多种芳香物质和淀粉酶、蛋白酶、半乳糖酶、核糖核酸酶等多种水解酶类，能赋予发酵食品优质的香气和甜味，因而是绝佳的酿酒菌种。红曲霉产
14、生的次级代谢产物如色素、抗菌素、胆固醇抑制剂等因有特殊的保健功能，近年来已成为人们研究的热点。,三、红曲的制作,红曲古称丹曲，是红曲霉生长在蒸煮过的米粒上形成的发酵食品。,生产工艺流程说明：沥干：一般至含水量25%-30%为止；蒸煮：至饭粒呈玉色，粒粒疏松，不结团块。蒸饭不能熟透。冷却：至约30即可接种；培养温度一般为30，相对湿度RH85%，培养一周后即可。,影响红曲发酵的因素 影响红曲发酵的因素很多，如菌种、原料、补水、空气相对湿度(RH)、温度、通气状况等。,（1）菌种 应选择生长快，适应性强、产红色素明显的菌株。（2）原料 选用无粘性的梗米或粕米，其淀粉含量高、营养丰富，且可吸收适量水
15、分。起始水分含量低，红曲色素易生成；水分含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以25-30为宜；,（3）补水 生长繁殖过程中需补充适量水分，尤其在生长旺盛期补水更显得重要。（4）RH 关系到水分的蒸发，对发酵影响很大，一般RH控制在85以上。（5）温度 适宜生长温度为20-37，通常采用30发酵。（6）通气 红曲霉是一种好气性微生物，培养中要注意保持良好的通气。,四、红曲霉的应用,1.医药上2.食品生产上,实验室红曲固体发酵,一、红曲菌菌种活化及扩大培养,培养基的配置 红曲菌种的培养基选用麦芽汁培养基，具体方法为：称取麦芽粉，比例为4g麦芽粉对应10ml麦芽汁，保证麦芽汁浓度在812。将麦芽粉
16、和水混匀，在电炉上加热至 70保持半小时左右。静置取上清液，加入2%琼脂粉，加热煮沸，搅拌均匀。灭菌 将培养液分装入几个锥形瓶中，包扎好，同时在一个空的锥形瓶中装入 100到200ml的清水。准备若干个培养皿用报纸包扎好。全部放入高压灭菌锅 121度 灭菌20分钟。,接种1、超净台 开启三十分钟后，通风5分钟后方可进行操作。2、在超净台下，选取菌种，取黄豆大的一小块放到无菌水中(冷却到60)。3、在60的水浴锅中水浴30分钟（杀死其它菌种，与其它菌相比红曲能耐高温）。4、待装有培养基的锥形瓶冷却到70左右时，用移液抢吸取1到3ml（贴上标签）溶有菌种的菌液 注入到 锥形瓶中，然后倒入培养皿中，
17、20ml 左右。5、等到培养基凝固然后将培养皿倒置培养。培养将培养皿倒置 放入30 恒温培养箱中培养。每天注意观察记录，及时取出染菌培养皿。,（1）制曲原料：优质籼米。（2）浸米：25以上浸米5-8h，大米吸水分约在28-30。（3）蒸饭：将浸好的米用清水淋去米浆水，沥干，即可蒸饭。上汽火力要强，待全部圆气以后蒸料3-5min，出饭率在135，饭粒呈玉色，粒粒疏松，不结团块。蒸饭不能熟透。,二、实验室红曲固体发酵,（4）摊凉接种：将蒸熟的曲料倒在干净的地方，迅速打碎团块，摊平冷却到30-32。然后，每50kg米接种红曲醪0.5kg（1%），混合均匀，再充分翻拌2-3次，操作要迅速，以减少杂菌污
18、染。待冷却到30-3l，即可堆料。（5）堆料：当菌种移植于新的培养基时，需要一段时间才能适应新环境，在室温25-30时，一般经15-18h，品温可升到43-45，此时从中心取出的饭粒有白色斑点，伴有微微清香气，此时即可进行发酵。,（6）发酵：将曲料摊在曲池上，厚度约50cm。开始时升温较快，经2h上升到40时即可开耙，耙后品温下降2-3。由于菌种繁殖力的加快，需将堆料厚度降至26cm左右，再经过1h，品温继续上升至37-38，再行开耙，继续降低厚度至13-17cm，维持品温在35-36，进行养花。再经8h左右，饭粒表层粒粒呈白色斑点。,（7）吃水与培育：花齐以后，将曲堆厚度调整为33-50cm
19、，品温维持在32-33，使菌丝大量繁殖。每隔lh拌曲一次，经27h左右，饭粒表面菌体增厚、曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点时即可吃水，使曲粒吸收一定水分，以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法：一边拌曲一边向曲池中喷晒无菌水（凉开水），使曲粒表面润湿并微胀。摊成17-23cm厚，待品温上升至36-37，将曲逐步摊开，厚13-17cm，每隔0.5h拌曲一次，以控制品温，使曲粒疏松、发育均匀。吃水6h后，品温控制在32-33，每隔lh拌曲一次，经24h，曲粒大部分呈淡红斑点状，表层略有干皮，这时行二次吃水，其法同第一次。再将曲粒摊平，厚5-7cm，每隔0.5h拌曲一次，将品温维持在30-32，曲粒菌
20、丝向内生长，曲粒由淡红逐步转向深红，表面略有干燥。,约经24h即可行第三次吃水。应视曲粒菌丝的生长情况，正确控制吃水时间，维持品温在30-32，厚度减至3.3cm左右。每隔lh拌曲一次，此时菌丝已生长到曲粒的2/3，内部色泽由深红转紫红，再经12h即可出房。如果曲室中有温度与湿度调节器，可减少大量手工劳动。出房后，将曲粒摊平风干，5-6天后即可晒曲。在每天8-9点晒曲2h，不得曝晒，分三次晒干。晒曲和其他工序同等重要，否则将减低曲的酶活力和繁殖力，曲粒也易变质。,（8）成品质量检查 外观检查：曲粒表层光滑紫红，曲粒中心呈玉色，不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲种特有的曲香，不得有酸气等不正常气味。生物与理化项目检查：水分12以下，容量，淀粉含量59-62%，无细菌和霉菌污染。（9）贮藏：将晒好摊凉的红曲，按质量等级分批贮藏在封闭容器内，严防受潮变质和虫蛀，从中挑选最优红曲种作为来年的生产曲种，单独贮藏于干燥、阴凉的地方，注意清洁卫生，特别是在多雨的霉季，空气湿度大，易导致红曲回潮变质，影响正常生产。,
