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1、结核病的研究进展,概 况,结核病是仅次于爱滋病的第二大感染性疾病。由于许多爱滋病死于结核，故在单一感染死因中，结核病仍居首位。自从在全球范围内开展DOTS以来，结核病的感染率、病死率及细菌耐药情况均有降低，但因各国具体实施状况存在很大差异，所以改善的速度十分缓慢，与预期目标相距甚远。对于全球结核病防治前景，许多专家并不表示乐观。,控制结核病的基本条件,及早发现，快速诊断和及时治疗 疾病发现率达到70%，有赖于广泛疾病普查治疗成功率85%，有赖于DOTS 这样结核病才能得到有效控制，每年递减率才能达到10%左右，如此高质量防治数十年后，结核发病率才会显著降低。,我国结核病疫情特点,感染人口基数大
2、，患病人数多，传染源多；发现率低，平均只有26%；DOTS覆盖率低；耐药患者多，WTO公布的耐药检测报告中，我国在特别警示国家和地区中名列第一；高危发病人群增多，如老年人群、糖尿病、AIDS等。,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,T细胞在结核病免疫中的关键作用:细胞免疫反应功能低下者是结核病的高危人群，而体液免疫功能低下者如多发性骨髓瘤，并不是结核病易感者。其中CD4+T细胞发挥了主导作用。Th1和Th2为两种功能不同的CD4+T细胞亚群，其分泌的细胞因子（CK）各不相同。,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,许多研究证实，结核免疫是由以灭菌为核心的保护性免疫反应和以组织坏死为特征的
3、免疫病理反应构成的，并由不同的结核抗原激发。保护性免疫反应是由保护性抗原活化的Th1细胞介导的巨噬细胞非特异性抗菌活性来完成的。Th1型CK主要有IFN，IL-12，lL-18D等。实验表明，敲出IL-12或IL-18基因，可使小鼠的结核杆菌的易感性明显增高；,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,由病原性抗原活化的Th2细胞则介导以TDTH细胞（迟发超敏反应性T细胞）为效应细胞的病理性免疫反应，并导致特征性组织坏死，Th2型CK主要有IL-4、IL-10、IL-13等。实验表明IL-10和IL-13均能抑制巨噬细胞杀灭结核杆菌的能力；小鼠敲除IL-10基因后可更快消除结核杆菌。,基础研究：
4、Th1型/Th2细胞因子失衡,据报道，机体感染结核杆菌后，Th1型CK反应超过Th2型CK反应达20倍时，可建立潜伏期感染，表明Th1型CK反应在抑制结核菌生长繁殖中发挥重要作用。临床实验表明，活动性肺结核患者外周血单个核细胞经结核抗原刺激后IFN-产生明显减少，IFN-基因无表达，而IL-10产生明显增加。但经两个月抗痨治疗后随着病情好转IL-12产量明显升高。,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,Condos等发现，涂片阴性非空洞性肺结核患者局部免疫反应以Th1优势为特征，BALF中IFN-分泌明显增高;而涂片阳性空洞性肺结核患者局部则以单核细胞和巨噬细胞为主，IFN-产生减少,但随着
5、抗痨治疗后临床症状改善，IFN-分泌细胞重新聚集到肺部。,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,由此可见：Th1型CK主要激活巨噬细胞，增强其杀菌能力，从而在结核感染中发挥保护性免疫作用。Th2型CK则抑制Th1型CK和IFN-的产生，降低巨噬细胞杀灭结核菌的能力，从而削弱结核免疫应答，与结核感染的进展、持续化和慢性化有关。,基础研究：Th1型/Th2细胞因子失衡,Th1型/Th2型CK的动态平衡是机体有效控制结核感染的根本保证，这种平衡一旦被打破，将导致结核病的发生和发展。,基础研究：结核杆菌基因组学,结核杆菌的全基因组测序工作已完成，共含441万个碱基对，约4000个基因，3924个开放
6、阅读框架。其中大部分用于编码脂类代谢酶；10%编码两类不相关的酸性蛋白，可能与产生抗原变异和逃逸免疫有关。约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤儿蛋白。,结核杆菌基因组学：耐药基因研究,在结核菌耐药基因研究中，近来发现：约90%95%的耐利福平菌株有rpoB基因突变；约47%58%耐药异烟肼菌株有katG基因突变，其余则inhA基因或ahpC基因突变；耐乙胺丁醇菌株与embA、embB基因突变有关；约72%耐吡嗪酰胺菌株与编码PZA酶的pncA基因突变有关。,基础研究：结核杆菌蛋白质组学,Jumy等对有毒结核菌株与无毒BCG进行比较蛋白质组学研究，发现有两种蛋白质仅在有毒菌株中高度表达
7、，菌种内变异非常小，有可能成为结核病早期诊断的分子标志。,基础研究：结核杆菌蛋白质组学,Bahk等采用比较蛋白质组学研究方法发现有两种蛋白质RRV369和RRV3874在结核杆菌中含量较高。然后采用联合酶联免疫吸附试验，对肺结核患者和健康人血清各100份进行检测，结果显示RRV369和RRV3874诊断肺结核的敏感性分别为74%和60%，特异性为97%和96%，有望成为肺结核早期诊断的分子标志物。,基础研究：结核杆菌蛋白质组学,Tuny等比对耐异烟肼菌株和敏感株的蛋白质组学差异，检测出了与异烟肼抗药性有关的蛋白。现在国际上已建立结核杆菌蛋白质组学跨国合作研究体系，计划在5年内阐明结核杆菌相关蛋
8、白的结构和功能，这将大大促进结核发病机制、抗痨治疗新靶点及新型疫苗的研究。,基础研究：细胞凋亡与结核病,结核病时巨噬细胞适度凋亡是一种免疫保护机制，可使结核杆菌丧失原有生存环境，导致细菌活力降低，也可清除炎症部位的感染细胞。吞噬结核杆菌的巨噬细胞发生凋亡后，细菌被包埋在凋亡小体内，又被循环单核细胞吞噬，这样可能会触发更为有效的细胞内杀菌机制。细胞凋亡还可抑制结核杆菌繁殖，防止结核感染播散。,基础研究：细胞凋亡与结核病,国外研究发现：线粒体膜结构的完整即线粒体渗透性转换（MPT）稳定，caspase激活降低和线粒体细胞色素C释放减少是巨噬细胞发生凋亡的标志，也是有效控制结核杆菌感染的特征。线粒体
9、膜完整性受损（MPT降低），caspase激活增加和线粒体细胞色素C释放增加是细胞坏死的表现，并造成无法控制的结核杆菌生长与繁殖。,基础研究：细胞凋亡与结核病,Hirsch等研究发现：活动性结核病患者CD4+和非CD4+T细胞自发凋亡以及结核杆菌诱导的凋亡发生率显著高于健康者，T细胞凋亡发生率与T细胞反应呈负相关，即凋亡率越高则IFN-、IL-2水平越低。经有效抗痨治疗后，自发的与结核杆菌诱导的凋亡发生率均下降50%，IFN-、IL-2水平升高38倍，这表明T细胞过度凋亡削弱了机体的抗结核免疫机制，与结核病发生和发展有关。,实验室诊断：病原学,抗酸染色和培养：痰涂片检出率（抗酸染色）约30%4
10、0%，痰中菌量必须多于5106/L才能检出；集菌法敏感性可达60%70%，与标本质量、检测者技术与责任心有关，但无法区分结核杆菌和非结核杆菌。国外报道，在痰标本中加入特殊荧光素作标记，可在荧光显微镜下进行区分。结核杆菌快速培养系统目前普遍采用MCIG和BACTEC，速度明显高于传统方法，平均9天可判定结果，缺点是放射污染率稍高。近来研制出一种快速变色培养基，敏感性与培养速度与之相当，且污染率低。,6,实验室诊断：病原学,噬菌体生物扩增法：分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒，只能感染相应的活分枝杆菌。噬菌体增殖周期速度快，在几分钟几十分钟不等，利用这些特性可用于结核杆菌的快速检测及药敏测定。,病原学
11、诊断：噬菌体生物扩增法,近些年来国内外对此法进行了大量研究，认为有以下优点：简便快速，操作简单，不含特殊仪器，检测标本仅需48小时可得到结果。灵敏特异，敏感度为200300条/毫升。安全可靠，该法将活体菌裂解杀灭，传染性小价廉,病原学诊断：噬菌体生物扩增法,但此种方法也存在很多问题：与某些非结核分枝杆菌有交叉反应。敏感度仍不够高，一般在7595%之间，且与痰菌含量有关，痰涂阳+为63.9%，+为71.97%，+为88.2%。操作影响因素多：需设立多种对照，以保证可靠性，且反应时间、温度、噬菌体活性含量及特异性、杀毒剂的浓度及混匀情况等均可影响检测结果。蛭弧菌感染：蛭弧菌是一种与噬菌体极其相似的
12、寄生微生物，可在活菌和死菌中增殖，裂解细菌后可产生菌斑，可造成假阳性，在操作中须避免污染。,病原学诊断：噬菌体生物扩增法,该法若要广泛用于临床，仍有大量工作必须完成：a.筛选出结核杆菌特异性高的噬菌体；b.试剂盒及检测方法的标准化。该法亦可用于结核杆菌药敏测定，但与常规药敏检测结果存在一定差异，须进一步研究明确其原因。近来美国学者构建了一种含荧光素酶基因的噬菌体，可用于多种一线抗结核药物的敏感性测定，并且一次可进行大量标本的检查，是迄今最快的药敏试验，今后须对该法进行标准化研究。,病原学：分子生物学诊断,PCR：PCR技术并不复杂，但要求标准化试剂盒，严格的技术质量控制和较高的实验条件。经过多
13、年努力，该方法不断完善，并开发出新的PCR技术，如实时荧光PCR、酶联PCR等，转录PCR等。但在临床上还存在一些问题，如不能区分活菌和死菌，存在结核杆菌滞后现象等。,病原学：分子生物学诊断,DNA序列测定：该技术具有很高的分辨率，可快速、灵敏、可靠地测定结核杆菌的特异性核苷酸序列和突变耐药基因。目前已有自动化DNA测序仪，但价格昂贵，难以推广。但随着该技术成熟、改进和完善，可望得以广泛应用。,病原学：分子生物学诊断,DNA探针技术：目前已有商业性试剂盒应市，但用于痰标本的检测结果不十分理想，主要缺点是敏感度性不高，标本中菌量需1010/L DNA才能检测出来，需依赖于培养，并且只能鉴别少数几
14、种结核杆菌。但随着结核杆菌全基因测序的完成，该技术研究正在突飞猛进，特别是将特异性强的核酸探针技术与敏感度性高的PCR技术相结合，已成为目前结核病诊断研究的热点。,病原学：分子生物学诊断,生物芯片技术：该技术具有高效、微型化、自动化、防污染、成本低等特点，分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片，随着结核杆菌基因计划的推进及蛋白组学研究的深入，可望在不久的将来，该技术将对结核病基础研究、病原学诊断等多方面产生巨大影响。,病原学：结核杆菌抗原测定,结核杆菌抗原测定：38KD蛋白是结核杆菌的主要免疫原，有学者采用酶联免疫法检测结核患者痰液、胸水及脑脊液中的该抗原，最低检出量可达到5g/L，有较
15、好的敏感性，但尚需进行大标本研究。,血清学诊断,血清学诊断简便快捷，是结核病诊断的百年追求。主要方法是测定血清和组织液中的特异性抗结核抗体，故结核抗原的选择至关重要。目前多采用PPD，但其所含抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（BCG）所共用，故PPD抗体阳性不能区分是分枝杆菌感染（致病性或非致病性）或是接种BCG的结果。,血清学诊断,目前发现了一些结核菌蛋白如38KD蛋白，BCG对其合成受到抑制，故可区分结核病患者与BCG接种阳性者，具有较好的特异性（94.9%），在菌阳患者中敏感性尚可（76%以上），但菌阴患者的敏感性较低（仅37.7%）是其缺点。,血清学诊断,14KD蛋白、1
16、8KD蛋白、MPT64、ESAT-6，以及脂阿拉伯甘露糖抗原等，特异性均较PPD抗原有所提高，可达78.6100%，但敏感性不高，各家报道差异很大，在31.7%94%之间，临床应用价值评价不一，故尚难成为结核病的确诊指标，,血清学诊断,目前认为该法对肺外结核的诊断有一定价值。关键仍在于寻找免疫原性和特异性均强的结核抗原，以及统一、规范、稳定的实验条件和试剂。联合应用多种抗原可以提高特异性抗体检测的敏感度。,皮肤试验,目前除OT和PPD外，近来有学者用特异性较强的ESAT抗原，可区分结核杆菌感染和BCG接种阳性者，但仍不能区分活动性结核病和隐性结核感染，故不能作为结核病确诊方法。,影象学诊断,目
17、前肺部疾病的影象学诊断仍以常规胸片为首选，以CT检查为主要方法，以MRI为辅助手段。胸部CT：各型肺结核均可显现以渗出、干酪样坏死、空洞、纤维化和钙化为特征的慢性演变过程，CT影象特征亦与此病理基础有关，而且可在同一CT片上全部或部分显示，由此形成了肺结核“三多”、“三少”的CT影象特征。,影象学：胸部CT影象特征,多灶性：为结核杆菌肺内播散的结果，除病灶周围可见卫星灶外，常经支气管向其它肺段或对侧肺部播散，又称之为肺门流沙样播散；亦可累及胸膜或纵隔淋巴结。多态性：肺结核慢性病理演变常随机体免疫力的变化及抗痨药物的干扰发生好转或恶化，或二者反复交替，形成肺内渗出、坏死、增生病变共存的病理状态，
18、故CT影象上亦出现各种形态共存现象。,影象学：胸部CT影象特征,多钙化：结核病灶在吸收好转过程中首先出现小颗粒状钙化，继而逐渐增多，往往由中央延向周围，钙化总容积常20%，对结核灶有诊断价值。少肿块：肺结核病灶大多呈非肿块性影象。以结核球为主时，由于外周有纤维包膜形成，故外缘完整，周围常有卫星病灶，可与分叶有毛刺的肺癌相鉴别。少堆聚：肺结核病灶以渗出或干酪坏死时可出现融合，CT密度较均匀，而较少出现小结节堆聚的癌灶现象。,影象学：胸部CT影象特征,少增强：用自动压力CT专用注射器采用静脉团注法进行增强剂静注，CT增强扫描时段必须掌握在注射后1520秒内的肺动脉灌注期，这样测出在同一层面同一病灶
19、增强前后的CT变化值才有诊断价值。以干酪样坏死或纤维化钙化为主的肺结核病灶因血管分布甚少，故强化不明显，CT差值一般30hu。必须注意，以增殖性肉芽肿为主的肺结核灶因血供亦较丰富，CT差值可达50hu，须结合其它肺结核的重要CT特征进行综合分析，作出判断。,影象学：核磁共振,MRI对纵隔病变、膈上下病变及病变起源的识别有很大帮助。可鉴别病灶是否为血管性（血管流空效应）以及是否侵袭纵隔或胸壁，可区分软组织肿块与粘稠胸水。,影象学：核磁共振,MRI在胸部应用也有许多缺点：由于肺信号弱，加之呼吸运动所致伪影的干扰，MRI对肺部细微结构的显示效果不好，如对毛刺、分叶切迹、线状粘连等的显示不如CT，也不
20、适用于支气管及间质改变为主的肺病变检查。MRI对钙化灶的显示不敏感。MRI对肺部病变有定位作用的叶间胸膜、叶段支气管和血管显示不清，也难以显示骨折。故MRI只能作为普通胸片和CT的重要补充。,影象学：正电子发射计算机断层显像,PET是以带有放射性标记的人体代谢物质为示踪剂的定量代谢显像技术，主要显示病灶或组织内是否有示踪剂明显浓聚。常用示踪剂F-氟代脱氧葡萄糖（FDG）在陈旧性结核、稳定期肺结核及干酪样坏死灶中多无明显浓聚；而增殖型结核则可摄取较多FDG，有明显汇聚现象，难以与肺癌相鉴别。有研究证实，肺癌的磷酸酰胆碱含量较高，以F-氟代甲基胆碱（FCH）作示踪剂对肿瘤鉴别有重要价值，可弥补FD
21、G显像的不足。,抗结核治疗,抗痨药物：上世纪80年代中叶起，抗痨药物的研制一度停滞达十余年。直至近些年来，由于多耐药菌株广泛流行，此领域的研究才重新成为热点。研究长期停滞的后果是，自1960年发现利福平以来，至今仍无高质量的新型抗痨药物问世，给多耐药结核病的治疗造成很大困难。,抗结核治疗：抗 痨 药 物,目前研究的主要方向之一是以经典药物为基础合成新的衍生物：当前最引人注目的是氟喹诺酮类，可能是不远的将来唯一可能有效的新药物。近来发现莫西沙星的抗结核活性很强，药代动力学特征也令人满意，甚至还可缩短目前的抗痨疗程。但是因该药在社区感染中广泛应用，易产生耐药，这也限制了该类药物的作用。,抗结核治疗
22、：抗 痨 药 物,吡嗪酰胺对酸性环境中处于部分生长抑制状态的细胞内外的结核杆菌具有比INH更强的杀菌作用。目前国外正在研制新的吡嗪酸类衍生物。氨硫脲衍生物的研究亦在进行中。5-硝基咪唑类衍生物作为新抗痨药物具有相当好的开发前景，其抗菌活性优于SM，与INH及RTP相似，但目前尚未应用临床。,抗结核治疗：抗 痨 药 物,现在美国、欧洲和亚洲实验室正在全力开展相关研究，数年来筛选了近万种可能具有抗结核作用的化合物，并取得一些进展，发现几种有希望的化合物（如双原子核八面复合物镍II等），但距离临床应用仍十分遥远，故必须开发新的治疗途径。,抗结核治疗：新的治疗途径,靶向释药系统：有学者以携带有吞噬刺激
23、素的RFP脂质体治疗实验鼠结核病，其杀菌效果比游离RFP至少提高2000倍，疗效非同一般，展现了令人鼓舞的前景。结核菌噬菌体：美国学者将TM4噬菌体引导入巨噬细胞，胞内结核杆菌在4天后减少50%以上。目前正在进行动物体内试验，若获得成功，将开拓另一新领域。,抗结核治疗：卡 介 苗,BCG:BCG为活细菌,用于HIV（+）/AIDS患者和免疫缺陷者有引起全身播散感染的危险。BCG接种在结核菌高感染地区预防效果差，如印度为0%；低感染地区预防效果好，如英国达77%。保护性免疫效果随着时间推移而减弱，约10年后完全消失。因此近些年来大力开展了新疫苗的研制，并取得许多进展。,抗结核治疗：卡 介 苗,重
24、组BCG疫苗：将失去的保护性抗原基因（如抗原85B基因等）导入BCG，使之表达更多的保护性抗原。实验证实接种后可增强机体的保护性免疫反应，减少病理性免疫反应，从而提高了实验动物的存活率。将能增强保护性免疫的Th1型细胞因子的基因（如IFN-基因、EL-18基因等）导入BCG，使之能合成分泌这些细胞因子，实验表明接种后可增强动物的保护性免疫反应。,抗结核治疗：卡 介 苗,抗结核亚单位疫苗：目前研究较多的是DNA亚单位疫苗，与卡介苗不同，DNA免疫（如DNA-抗原85B、ESAT-6质粒等）不仅能诱导强烈的Th1型免疫反应，还能诱导IFN-分泌的CD8+T细胞免疫反应。这两种细胞反应都是抗结核保护性免疫所必不可少的。目前新疫苗研究进展迅速，可望在10年内能有一种或多种新型疫苗获准应用于临床，将对结核病的最终控制发挥重要作用。,
