维生素类药物的分析.ppt

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1、药物分析学（第14章）,维生素类药物的分析（1）,本节教师：韩海（博士/副教授)暨南大学药学院Tel:18620908821E-mail:thanhaikQQ:56011856,2013.10.30,维生素类药物的分析,基本内容维生素A、维生素B1、维生素C、维生素D和维生素E的结构和性质、鉴别试验、含量测定，以及游离生育酚的检查。基本要求掌握：维生素类药物的结构与分析方法的关系，维生素A的紫外分光光度法，维生素C的碘量法。,维生素类药物的分析,熟悉：维生素A的三氯化锑反应及比色法，维生素E的鉴别试验及气相色谱法，维生素B1的硫色素反应及紫外分光光度法、非水滴定法，维生素C的2，6二氯吲哚酚滴

2、定法，维生素D的鉴别试验。了解：该类药物的其他分析项目与方法，维生素D含量测定的高效液相色谱法，维生素A三点校正法的推导过程。,课时安排：总学时：（5学时）维生素A、维生素B1（3学时）重点内容：维生素A的紫外分光光度法 维生素C、D、E；复习及习题（2学时）,概 述,特点：1.非蛋白质、非脂肪、非糖类的有机化合物.具有较强的生理活性，体内不能合成。2.多为醇、酯、胺、酸、酚和醌类；各具不同的理化性质和生理作用。,维生素A(retinal),维生素D3(colecalciferol，胆骨化醇),维生素B1(Thiamine hydrochloride,盐酸硫胺),3.分类:脂溶性和水溶性脂溶性

3、：维生素A、D、E、K等；水溶性：维生素B组(B1、B2等)、烟酸、泛酸、叶酸及抗坏血酸。其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。4.测定方法:生物、微生物、化学和物理化学的方法.,第一节 维生素A的分析,维生素A主要存于动物性食物中，但有色植物中的-胡萝卜素即VA原含量丰富。,第一节 维生素A的分析,维生素A 维生素A1（视黄醇）维生素A2（去氢维生素）维生素A3（去水维生素）全反式维生素A,一、结构与性质,维生素A(retinal),1共轭多烯结构：具有强紫外吸收（在325328nm有最大吸收），可采用紫外吸收光谱法进行鉴别，采用紫外

4、分光光度法进行含量测定。存在多种立体异构化合物天然维生素A是全反式维生素A。其它异构体具有相似的化学性质，但生物效价不同。（表9-2）,相对生物效价,维生素A（全反）325.5 100%新维生素Aa（2-顺）328 75%新维生素Ab（4-顺）320.5 24%新维生素Ac（2、4-顺）310.5 15%异维生素Aa（6-顺）323 21%异维生素Ab（2、6-顺）324 24%,一、结构与性质,2.结构式中R的不同，可以形成维生素A醇或其酯。临床上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。（表14-1）3.易氧化变质：有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，生成无活性物质。,-H 维生素A醇-C

5、OCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R:,去氢维生素A（A2 dehydroretinol),去水维生素A（A3 anhydroretinol),一、结构与性质,4.溶解性：（脂溶性）能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。5.能与三氯化锑呈色：在氯仿中能与三氯化锑试剂作用，产生不稳定的蓝色。,二、鉴别试验,（一）三氯化锑反应（Carr-Price反应）维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。,SbCl5,二、鉴别试验,讨论：1.实际起作用的是三氯化锑()中存在的Lewis酸氯化高锑(V)2.反应要用无醇氯仿，因为

6、醇的存在要作为亲核反应物与正碳离子反应而使其正电荷消失。3.反应要无水，水可使三氯化锑水解为氧氯化锑。,（二）紫外吸收特征：1.直接测定维生素A1 在326nm处有最大吸收。2.酸消去后测定维生素A3（去水维生素A）在332nm附近有曲折，在348、367、389nm附近有吸收峰。1、为什么吸收带红移？2、为什么吸收峰变多？,二、鉴别试验,Vit A,Vit A3,维生素A(醇)在盐酸存在下解离，随即正电荷转移至紫萝酮环上的碳上，然后失去一个质子而生成去水维生素A：,1、为什么吸收带红移？去水维生素A比维生素A多一个共轭双键，因而红移。Konjugierte吸收Fieser规则、Scoot规则

7、 2、为什么吸收峰变多？（思考题，请查询紫外光谱原理的相关资料）,（三）薄层层析条件1：（BP2000）硅胶板溶剂：环己烷展开剂：环己烷乙醚（80:20）三氯化锑试剂显色，以标准品同时进行对照条件2：硅胶板溶剂：氯仿展开剂：环己烷乙醚（80:20）磷钼酸显色，以标准品同时进行对照,三、含量测定,维生素A的测定CHP收载三种,HPLC法,UV,三氯化锑法,三、含量测定,紫外分光光度法三氯化锑比色法（专属性差，显色不稳定）前者是法定方法，后者多用于食品或饲料中的维生素A的测定（行业方法）。HPLC法具有强紫外吸收（在325328nm有最大吸收），可采用紫外分光光度法进行含量测定。,紫外分光光度法,

8、目前各国药典均采用紫外分光光度法测定维生素A的含量。本法快速、准确、经济，测定结果能比较正确地反映维生素A的效价。如何测定？1.根据紫外光谱数据:定量 维生素A在不同溶剂中的紫外吸收数据,其最大吸收峰的位置随溶剂的不同而异,2.能否直接测定？能直接测定 的条件：1.仪器符合药典的要求 2.溶剂及样品中的基质等其他组分在测定波长处无干扰（1）而维生素A原料药中常混有杂质，如维生素A2、维生素A3。,（2）维生素A的氧化产物：,（3）维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇：,（4）维生素A的顺反异构体；（5）合成时产生的中间体 这些杂质在维生素A的最大吸收波长（310340nm）波长范围内有

9、吸收，干扰维生素A的测定，所测得的吸收度不是维生素A所独有。,所以不能直接测定维生素A的 用于定量 要消除杂质的干扰三点校正法,三点校正法测定维生素A的含量,本法是用在三个波长处测得吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量。原理：杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。物质对光的吸收度具有加和性，因而吸收曲线也是他们吸收曲线的叠加。,原则：最大吸收波长处一点，最大吸收波长的两侧各选一点。1.中国药典测定维生素A醋酸酯等波长差法在 1的左右各选一点为 2和 3；使 3 11 2。规定 1328nm，2316nm，3340nm,2.中国药典测定维生

10、素A醇等吸收比法在 1的左右各选一点为 2和 3；使A 2A3=6/7A 1。规定 1325nm，2310nm，3334nm,第一法：测定维生素A醋酸酯的方法等波长差法基本思想：先判断杂质的干扰是否影响测定及影响程度（五点波长法），再决定用哪个吸收度进行含量计算。1.取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成每1m1中含915单位的溶液。然后在300、316、328、340、360nm五个波长处分别测定吸收值。,测定方法中国药典,2.A值的选择法:按中国药典附录 J维生素A测定法的规定。计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收度的比值。并确定最大吸收波长(应为328nm)。,五个吸收度比值分

11、别与规定的吸收度比值相减，即得到五个差值。判断每个差值是否超过规定的0.02。,1.理想状况:杂质几乎没有形成干扰。判断标准：最大吸收波长在326329nm之间，计算吸收度比值Ai/A328，并与规定值相减，差值不超过0.02 A值选择：选择A328计算含量2.非理想状况:杂质有干扰。判断标准（符合以下两点之一）(1)最大吸收波长在326329nm之间，5个波长下的Ai/A328与规定值之差有一个或几个超过0.02；(2)最大吸收波长不在326329nm之间。,A值选择：先计算出：再计算出 再根据以下三种不同情况选择（1）若所得的数值在3%，表明杂质干扰很小，则仍用A328计算含量；（2）若所

12、得的数值在-15%-3%之间，表明杂质有一定的干扰，则需用A328（校正）计算含量；,如何计算标示量的百分含量？第二步：求第三步：求效价（IU/g）：效价系指每克供试品中所含维生素A的国际单位数。如何换算成效价（IU/g）？换算因子：定义为每1个 数值所相当的效价。,（C单位为g/100ml）,VitA的标示量为效价！,1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数为：,效价IU/g=E 1cm1%1900(溶剂:环己烷),1g维生素A醇相当的国际单位数为：,效价IU/g=E 1cm1%1830(溶剂:环己烷),第四步：求标示量标示量样品标签上注明的每胶丸含有的维生素A醋酸酯的国际单位数(效价，非含量！)

13、1.求维生素A醋酸酯胶丸为标示量的百分含量:IU/丸 标示量%=-100%标示量IU/丸=IU/g g/丸=IU/g W IU/g W 标示量%=-100%标示量,测定含量,单位质量1g对应的效价,效价占单位样品质量的百分比,效价（标示）占单位质量的百分比,或者：A直接测得的A328或校正后的A328(校正)；D供试品的稀释倍数；1900换算因数；W胶丸的平均内容物重量，g；W称取供试品取量，g；l比色池厚度，cm；标示量样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。,（3）若所得的数值小于-15%或大于+3%，或最大吸收波长不在326329nm之间，表明杂质干扰很大，已经不适宜再用

14、本法测定。则应采用第二法（皂化法）测定。图示：,用第二法测,定,用,A328,（校正,）,计算,用,A328,计算,用第二法测,定,-,15,%,-,3%,0,+3%,第二法：中国药典适用于维生素A醇（含杂质较多的维生素A）的方法等吸收比法、6/7A法,第一法无法消除杂质干扰时用此法,2.A值的选择法:按中国药典附录 J维生素A测定法的规定。,判断max是否在323327nm之间,计算,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,判断 A300/A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,如何计算含量？1.求E 1cm1%E 1

15、cm1%=A/CL（C单位为g/100ml）2.求效价（IU/g）：IU/g=E 1cm1%18303.求维生素A醇为标示量的百分含量:IU/丸 标示量%=-100%标示量IU/丸=IU/g g/丸=IU/g W IU/g W 标示量%=-100%标示量,A直接测得的A328或校正后的A328(校正)；1830换算因子；D供试品的稀释倍数；W胶丸的平均内容物重量，g；W称取供试品取量，g；l比色池厚度，cm；标示量样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。,关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论,1）维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来：维生素A

16、醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或6/7定位法）推导而来。（了解）,关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论,2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此：在测定前务必要校正波长，（ChP，Appendix IV A）可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对仪器波长是否准确。测定的样品应不得少于两份。,关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论,3）皂化后提取应避免强烈振动以免引起乳化。皂化的全部过程应连氮并应在最短时间内完成。标准品及样品的处理，

17、应避免接触金属器皿。4）不适宜用第一法测定的维生素A醋酸酯。改用第二法（皂化法）测定后。其换算因子也相应改为维生素A醇的换算因子1830，计算时必需注意！5）中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。,应用示例一,VitAD胶丸中VitA的含量测定,精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计

18、算Vit A的标示量百分含量。,A=A328校正,维生素A的HPLC法（请自学）,色谱条件正相色谱法！,色谱柱：硅胶柱流动相：正己烷-异丙醇（997:3)检测波长 325 nm外标法：Vit A 酯,维生素A的三氯化锑比色法,原理：维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，max 618nm620nm，符合Beer定律。方法：标准曲线法。特点：1.需在510秒钟内测定。呈色不稳定 2.受温度影响很大3.需要无水条件4、三氯化锑有腐蚀性,5.非专属反应；如新维生素A、去水维生素A及胡萝卜素等物质，均与三氯化锑均显蓝色，故在测定天然维生素A时，测定值往往偏高.6.简易，操作迅速。目前

19、仍为食品或饲料中维生素A测定常用的方法。,第二节 水溶性维生素维生素B1的分析,VB1又称盐酸硫胺素，是由一个噻唑环和氨基嘧啶环通过亚甲基连接而成的季铵化合物。在生物体内主要以焦磷酸硫胺素（TPP）形式存在。VB1和糖代谢关系密切，当缺乏时造成丙酮酸积累易引起神经炎和脚气病。,氨基嘧啶环,噻唑环,亚甲基,季铵,亦称盐酸硫胺,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病,一、结构及性质,结构特点：1氨基嘧啶环和噻唑环：具有硫色素反应，此反应专属性强，用于鉴别和含量测定。2.母核具N杂环，有弱碱性，1）可以与生物碱沉淀剂反应，产生沉淀，用于鉴别与含量测定。

20、2）可以在冰醋酸中与高氯酸定量反应，用于含量测定。3共轭体系：具紫外吸收，用于含量测定。4盐酸根：呈氯化物的反应，用于鉴别。,一、结构及性质,理化性质(1)溶解性 本品在水中易溶，水溶液显酸性反应。在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。(2)具有紫外吸收 本品约12.5 gm1盐酸溶液(91000)，max=246nm，百分吸收系数为406436。(3)在碱性中遇氧化剂，如铁氰化钾，可被氧化为具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光。,(4)分子中含有两个杂环(嘧啶环和噻唑环)，故可与某些生物碱沉淀试剂(如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液、硅钨酸等)反应生成组成恒定的沉淀。(5)水溶液呈氯化物的反应，用于

21、鉴别。(6)干燥品很稳定，酸性水溶液稳定，在碱性溶液中，噻唑环开环，迅速分解。,二、鉴别试验,(一)硫色素反应硫色素反应为维生素B1所特有，中国药典以此进行鉴别。(1)原理(2)方法 取本品约5mg，加氢氧化钠试液2.5m1溶解后，加铁氰化钾试液0.5m1与正丁醇5m1，强力振摇2min，放置分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光。加酸使成酸性，荧光即消失。再加碱使成碱性，荧光又显出。,(二)沉淀反应(1)(2)(3)(4)与苦酮酸作用形成不溶于水的扇形两头弯成螺旋状的白色结晶。其他维生素与苦酮酸不发生反应！,嘧啶环 伯氨,噻唑环 季铵,H+,H+,（三）加碱分解后与醋酸铅反应 水溶液加醋醋铅试液和

22、氢氧化钠试液并加热，溶液由黄色棕色最后生成黑色沉淀。苛性碱分解维生素B1，产生的硫化钠与醋酸铅作用生成黑色硫化铅沉淀。,S元素反应,（四）水溶液显氯化物的特殊反应,Cl-反应,三、含量测定,方法种类：硅钨酸重量法、BP（1998）硫色素荧光法、USP（24）非水溶液滴定法、（Chp 测定维生素B1原料药）紫外分光光度法。（Chp 测定维生素B1制剂）,1硅钨酸重量法简介BP（2000）、Chp（1990）方法维生素B1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀，根据沉淀的重量即可计算其含量。特点：原理简单，但操作繁琐费时，试剂易得，结果较为准确。,MW：3479.22,2.硫色素荧光法 p222USP（

23、24）方法原理:盐酸硫胺在碱性溶液中，被氧化剂（如铁氰化钾）氧化生成硫色素，用异丁醇提取，在紫外光照射下呈现蓝色荧光，与已知浓度的标准品溶液所得荧光进行比较或测定荧光强度，可求得供试品中B1的含量。,方法：教材P2601.铁氰化钾溶液要新配2.标准品、供试品逐步定量稀释3.标准品、供试品各测定两份以上,取均值定量。并与空白试验校正。,讨论1.硫色素反应为维生素B1所特有，为高专属性反应。适用于维生素B1制剂的含量测定.2.反应非定量完成，但在一定条件下，形成的硫色素与维生素B1浓度成正比.3.操作繁琐费时,且干扰荧光测定的因素较多.,3.非水溶液滴定法：（Chp2000 测定维生素B1原料药的

24、方法）原理:维生素B1分子中有两碱性基团，在非水溶液中均可与高氯酸作用。根据消耗高氯酸的量可计算维生素B1的量,方法：教材P220221,摩尔比为12，滴定度为16.86mg/ml,喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）,讨论：教材P221 1.加入醋酸汞的作用:2.反应摩尔比为12，分子量为337.27，滴定度为16.86mg/ml。3.也可以用电位法指示终点.(更精确),4紫外分光光度法：（Chp2000 测定维生素B1片剂及注射剂）原理 维生素B1分子中具有共轭双键结构，故具紫外吸收，在一定波长下测定吸收度即可定量。,1、0.1M盐酸2、水3、PH=7磷酸盐缓冲液4、乙醇,方法:（维生素B1片剂）取

25、本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B125mg)，置100ml量瓶中，加盐酸溶液(91000)约70ml，振摇15min，使维生素B1溶解，加盐酸溶液(9 1000)稀释至刻度，摇匀，定量滤过后，再用盐酸溶液(9 1000)稀释20倍。在246nm波长处测定吸收度，按C12H17ClN4OSHCl的吸收系数(E 1cm1%)为421计算，即得。,片剂、注射剂,=421,（每片）相当于标示量的%=,A=ECL,规格g/片,g,ChP,（每ml）相当于标示量的%=,规格g/ml,ml,%,式中，A吸收度；D供试品稀释倍数；W平均片重；W称取的片粉重。维生素B1注射液（自学）,讨论：维生素B1在紫外光区的特征吸收峰随溶液pH的变化而变化。在pH=2时，最大吸收在246nm处，E 1cm1%=421，测定时溶液的pH应为 2。（0.1mol/L HCl),1、0.1M盐酸2、水3、PH=7磷酸盐缓冲液4、乙醇,