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1、YL-1,分子生物学实验（综合性）,质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定,常规PCR技术,感受态细胞的制备及重组质粒的转化,真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测,YL-2,质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定,实验,实验安排,上午：质粒DNA 的提取与纯化,中午：质粒DNA 的酶切下午：电泳鉴定,质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链DNA。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。是重组DNA技术中重要的载体。,质粒,作为载体的质粒：多克隆位点 选择标记 容纳较大的外源DNA,质粒的特性：相对独立性 独立
2、的复制单位 赋予宿主细胞一些表型 与宿主菌染色体DNA不同,质粒,提取质粒DNA的目的与意义,基因载体/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。,如何获得批量的纯化质粒DNA分子？,（一）载体的制备：质粒DNA的提取与纯化,提取方法概述,碱裂解法分离纯化质粒DNA,基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的 差异。,当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，
3、离心时可沉淀下来。,原理示意图,溶液：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl溶液：0.2mmol/L NaOH,1%SDS 溶液：pH4.8,K+=3mol/L,（pH4.8）Ac-=5mol/L,重要试剂,碱裂解法提取质粒的流程,离心收集菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,1.取1mL菌液于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。2.将细菌沉淀悬浮于100L冰预冷的 溶液I 中，振荡混匀。3.加200L新鲜配制的溶液II，盖紧管盖，
4、上下轻柔颠倒离心管混匀5次（勿强烈振荡），冰上放置2min。4.加入150L预冷的溶液III，将管轻柔上下颠倒数次（6-8次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤1中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。步骤3、4中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混 匀，勿强烈振荡，否则质粒容易断裂。,菌液：E coli JM109菌株(含pUC19-X基因重组质粒),5.12000rpm离心5min，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。6.加等体积（约450L）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另一1.5mL
5、离心管中。7.加1mL冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000rpm离心5min，弃上清。8.加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。9.弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。10.加20L含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以去除RNA。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。,下一步实验用,提取质粒后分装,每人最终得到20L质粒DNA，其中10L用于酶切，5L用于电泳，其余5L用于下次的转化实验，切记！,实验
6、注意事项,移液枪的正确使用 标记好自己的离心管 加不同溶液要换枪头 转移上清时不要吸到沉淀 使用酚:氯仿注意安全 离心机的使用：严格平衡,注意,（二）质粒DNA的酶切及电泳鉴定,识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点。例如 EcoR的切割位点：G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位点：AA G C T T T T C G AA,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,本实验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。如果用EcoR和Hind 同时切割重组
7、质粒（含两个单一酶切位点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。,使用限制性内酶切的原则,限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；酶的用量可参照酶单位的定义确定；两种以上的酶切割DNA时应选择合适的缓冲液；酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。,质粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6L,21,合计 20L,准备室老师已将其配成2限制性酶反应混合液,双酶切体系的建立,重组质粒的酶切反应,2限制性酶反应液包含：10酶反应缓冲液、EcoR I、Hind III,核酸电泳,核酸分子是两性解离分子
8、，在pH8.0pH8.5时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。,具有不同的相对分子 质量的DNA片段在凝胶中泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小或构型来使其分离。,质粒的三种构型,电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,最快,中,最慢,重组质粒双酶切电泳,DNA 标准（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题以及估算条带的大小。,质粒DNA电泳步骤,制胶取酶切后的质粒DNA溶液20 L、酶切对照的质粒DNA溶液20L，各加5上样缓冲液5 L，混匀后，用移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入 5 L D
9、NA Marker至另一样品孔中。电压120V，电泳约40min-1h。,点样：,开环构型线性构型超螺旋构型（希望得到最多）,预期电泳结果,酶切后,提取的质粒,2.5Kb,0.9Kb,小结,1质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒 DNA与染色质DNA变性与复性的差异。2质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的DNA序 列，并切割双链DNA。本实验中EcoR I、Hind III将3.4 Kb的质粒双酶切为2.5 Kb和0.9Kb的两个片段。3电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶 中泳动速度不一样使其分离。,思考题,1.碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理是什么？结合基本原 理分别讲述溶液、发挥怎样的作用。2.实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？3.如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？4.如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结 果？,
