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1、第十一章 重组蛋白表达体系,2,2023/6/26,第六节 转基因体系,第五节 哺乳动物表达系统,2023/6/26,3,表达载体的特点*宿主细胞报告基因载体*表达体系类型 重组产物的分离纯化,2023/6/26,4,I.表达载体的特点,具有克隆载体所具有的基本特性具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件：,启动子序列,转录终止序列,核糖体结合位点,？,2023/6/26,5,穿梭载体,穿梭载体（Shuttle Vector）指能在两种不同的生物中复制的载体例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核
2、生物的自主复制序列（Autonomously Replicating Sequence,ARS）以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在真核细胞中用于基因表达分析,6,2023/6/26,真核细胞,原核细胞,宿主细胞,文本,文本,文本,文本,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,链霉菌,酵母细胞,哺乳动物细胞,昆虫细胞,7,2023/6/26,大肠杆菌表达特点:重组蛋白基本无信号肽，多为胞内产物，分离时需破碎细胞，胞质内其他蛋白的释放而使纯化困难分泌能力差，真核重组蛋白常形成不溶包含体，表达产物在提纯过程中须经变性和复性处理后才能恢复其生物学活性不同的表达形式具不同
3、的表达水平，且会带来完全不同的杂质无翻译后修饰，不能糖基化转译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应产生难去除的内毒素，还会产生蛋白酶而降解重组蛋白质,原核细胞,8,2023/6/26,枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌,9,2023/6/26,酵母：繁殖迅速，低成本大规模培养，没有毒性，基因操作与
4、原核生物相似，表达产物可直接分泌到细胞外而简化分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。如干扰素和乙肝表面抗原已获成功丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物及相似；安全，有成熟的发酵以后处理工艺 理论上讲，各种微生物都可用于基因表达，但因克隆载体、DNA导入法及遗传背景等限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母,真核细胞,10,2023/6/26,哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。产物是糖基化
5、的，接近或类似于天然产物但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀昆虫细胞:兼有酵母和动物细胞的优点,2023/6/26,11,报告基因载体,2023/6/26,12,原核生物表达体系*真核生物表达体系酵母表达载体*昆虫表达载体动物细胞表达载体*Ti质粒及其衍生载体,表达体系类型,13,2023/6/26,生物技术产品特点:目的产物在初始原料中的含量较低含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面
6、张力等十分敏感，容易是其失活、变性种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质应用面广，质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热,重组产物的分离纯化,14,2023/6/26,原核生物表达载体 重组表达要素外源基因的重组表达,优点：操作简单、产量高、成本低缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性,15,2023/6/26,原核生物表达载体,表达载体必须具备的条件启动子核糖体结合位点转录终止序列,16,2023/6/26,能独立复制具灵活的克隆位点和方便的筛选标记,克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达
7、具强启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别启动子具调控机制，只有当诱导时才能进行转录具强终止子，使RNA聚合酶只转录克隆的外源基因所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（核糖体结合位点），以便转录后能顺利翻译,表达载体必须具备的条件,问题:,阻遏蛋白repressor的阻遏作用对宿主有何影响？对外源基因的表达有无响？,2023/6/26,17,启动子,大肠杆菌表达载体中常用的启动子：（1）trp-lac启动子（又称tac启动子）tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳
8、糖苷（IPTG）的诱导表达（2）噬菌体PL启动子 特点：受温度的控制，低温（37C）下被阻遏而抑制，高温（42 C）下去阻遏而激活（3）T7，SP6噬菌体启动子,2023/6/26,18,核糖体结合位点（RBS）,RBS由SD序列、核糖体小亚基识别序列和起始密码（ATG）组成但有时也将SD序列称为核糖体结合位点SD：Shine-Dalgarno，人名,2023/6/26,19,转录终止序列,一般由一段GC富集区组成的反向重复序列，具有回纹结构，转录产物的对应区可行成“发夹”结构转录终止机制有两种：依赖因子的转录终止不依赖因子的转录终止,20,2023/6/26,重组表达要素,影响重组表达的因素
9、重组表达方式表达系统的标准,21,2023/6/26,外源基因的表达产量-单位体积产量-细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量；单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。因此必须从以下因素入手，寻找提高外源基因表达效率的有效途径：（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率：启动子的强弱：目的基因插入启动子的下游，lac、trp、tac、bla核糖体结合位点的有效性SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平密码子组成：设计引物或合
10、成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子（3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽；特异性突变；位点特异突变，改变二硫键位置；宿主蛋白酶缺陷（4）细胞的代谢负荷：宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开（5）工程菌的培养条件,影响重组表达的因素,22,2023/6/26,融合蛋白表达：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原，一般不做人体注射用药?非融合蛋白表达：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应分泌蛋白表达：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游,重组表达方式,23,2023/6/26,选择表达系统的标准,尽可能低的
11、诱导前泄漏表达快速、简便的诱导方式能够高表达多种基因易进行克隆操作能直接进行点突变和DNA序列分析而不需要亚克隆，满足蛋白质工程的需要,24,2023/6/26,外源基因的重组表达,pET表达体系融合蛋白的表达分泌蛋白的表达蛋白包涵体,25,2023/6/26,优点,T7RNA聚合酶转录速率高于大肠杆菌的5倍T7RNA聚合酶只识别T7启动子，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录，可使该启动子控制下的基因得到充分表达T7RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性，可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列，高效表达在其它表达系统中不能有效表达的基因该表达系统表达的基因产物可占细胞
12、总蛋白的25%以上,pET表达体系,26,2023/6/26,表达载体与受体细胞,pET表达体系是目前最常用大肠杆菌重组表达系统之一，表达载体以系列应用如表达载体pET28a：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等pET表达系统中的大肠杆菌受体细胞能产生T7RNA聚合酶，如BL21(DE3),27,2023/6/26,实验方法,以载体pET28a、受体菌BL21（DE3）为例，简述基因表达与蛋白质鉴定的基本步骤：目的基因与载体pET28
13、a连接，转化大肠杆菌BL21（DE3）转化物涂布于LB/卡那霉素/IPTG平板，37度培养过夜挑取几个单菌落于LB/卡那霉素/IPTG培养基中，37度培养制备质粒DNA，以限制性酶切分析确定基因是否正确插入；必要时进行PCR扩增、测序，以确证克隆的正确性选择正确的克隆，诱导时间的确定和适度规模的表达,28,2023/6/26,融合蛋白表达,融合表达 基本原理：将目的基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（菌体蛋白）基因的下游，表达出N末端为菌体蛋白而C端为目的蛋白的融合蛋白蛋白质融合表达的优点：能产生大量可溶性融合蛋白；帮助生成折叠正确、有生物活性的目的蛋白；易于目的蛋白的分离,29,2023/6
14、/26,许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后，能保留原有的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫原性能得到加强。用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体，能够用于检测原来的多肽药物，也可用于药物动力学与药物受体研究及药物产品检测 有些情况下，采用融合蛋白表达外源基因是因为一些多肽药物在原核细胞中不稳定，难以获得高表达。这些蛋白与菌体蛋白融合后得到稳定，但融合蛋白需经过后处理才能释放出有活性的外源多肽 多肽药物纯化通常较为困难，但与特定原核蛋白融合后，不仅能稳定其表达产物，还能用融合蛋白的配体进行亲和层析纯化。如GST-融合基因，所产生的融合蛋白可用谷胱甘肽亲和柱一次性纯化,以融合蛋白表
15、达的药物基因,30,2023/6/26,缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难大量表达可容性蛋白,融合蛋白表达的局限性,31,2023/6/26,稳定融合蛋白的方法：将融合蛋白以不溶性的聚集物形式表达采用缺失抑制蛋白酶的大肠杆菌作为宿主，减少不稳定蛋白的降解试用不同的野生型菌株,32,2023/6/26,融合蛋白的位点特异性裂解：化学裂解:溴化氰（Met）、羟胺（AsnGly）、低pH（AspPro）来进行融合蛋白的化学裂解酶解：反应条件温和、高度专一性。比如凝血酶、肠激酶、Xa因子、凝乳酶、胶原酶等。如：GST融合系统载
16、体含有凝血酶裂解位点、Xa因子，裂解位点或是天冬氨酸-脯氨酸裂解位点Trx融合系统采用肠激酶裂解位点,33,2023/6/26,GST融合蛋白的表达及纯化,使用pGEX载体。每个pGEX载体都有一个编码谷胱甘肽S-转移酶（GST）的开放阅读框，后面带有BamHI、SalI、XhoI的单一限制性内切核酸酶位点，在此处插入目的基因受体为普通的大肠杆菌感受态细胞,实验操作方案,克隆、微量表达及SDS-PAGE鉴定常量诱导表达酶解、SDS-PAGE鉴定,2023/6/26,34,35,2023/6/26,Trx融合蛋白的表达与纯化,硫氧还蛋白(Trx)与目的基因蛋白的融合蛋白，多可正确折叠，并表现出生
17、物学活性大多数硫氧还蛋白融合蛋白的产物水平占细胞总蛋白量的5%-20%该系统特别适合于在大肠杆菌胞质中表达高产量的可溶性融合蛋白,36,2023/6/26,Thioredoxin Fusion Sequences(Invitrogen,pTrxFUS and pThioHis Vectors),Thioredoxin improves solubilityof the fused protein,in E.coli,thioredoxin accumulates in adhesion zones,which can be selectively released by rapid osmot
18、ic shock,Thioredoxin is stable up to 80C,Thioredoxins are sulfhydryl oxidoreductases that can convert a vicinal dithiol to a disulfide.,37,2023/6/26,分泌蛋白的表达,含义：许多分泌蛋白以带有N端信号肽的前体形式在细胞质中合成，随后穿膜运输到周质或定位到内、外膜上。在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除如果将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游就有可能实现分泌表达,38,2023/6/26,蛋白分泌表达的优点,分泌蛋白前端的信号肽被切除后生成的蛋白质
19、N末端氨基酸残基和天然的产物是一致的周质空间中的蛋白酶活性低于胞质，使所表达的蛋白能稳定的存在于周质中周质中只有少量的细菌蛋白，他们仅占细菌总蛋白的4%，有利于重组蛋白的分离纯化周质空间提供了一个氧化环境，有利于二硫键正确形成,39,2023/6/26,分泌表达需要注意的问题,选择合适的信号肽和融合子：可以使目的蛋白顺利转移到周质空间合适的培养条件：影响目的蛋白分泌速度和分泌水平选合适的菌株：不同菌种，分泌效果不同,40,2023/6/26,分泌表达研究工作,宿主菌的改造、共表达和培养条件优化改造信号肽的序列和结构,41,2023/6/26,蛋白包涵体,基本原理：重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由
20、于表达量高，通常重组蛋白会以包涵体形式m的固体颗粒这些颗粒需要经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性,42,2023/6/26,形成包涵体的原因,重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需要的酶类，导致中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀缺乏蛋白质折叠过程中所需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键重组蛋白的氨基酸组成和其所处的环境同样影响包涵体的形成。一般含硫氨基酸越多越容易形成包涵体；发酵温度高或胞内pH接近蛋白等电点时容易形成包涵体,43,2023/6/26,减少包涵体的策略,降低重组菌的生长温度添加可促进重组蛋白可溶性表达的生长添加剂供给丰富的培养基，创
21、造最佳培养条件，如供氧、pH 等,44,2023/6/26,形成包涵体的有利之处,可获得高表达、高纯度的重组蛋白质避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏,45,2023/6/26,金属螯合剂：如EDTA。螯合金属离子，避免与还原状的巯基氧化,还原剂：如DTT。打开二硫键。含二硫键的杂蛋白影响包涵体溶解,酸：如70%甲酸。可以破坏次级键而增溶蛋白，适用于少数蛋白,去污剂：如SDS。破坏蛋白内部的疏水键，增溶几乎所有的蛋白,强变性剂:8mol/L尿素等。破坏离子间的相互作用而破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白,包涵体的溶解（变性）,46,2023/6/26,包涵体有效复性的特点,活性蛋白质的回收率高正确复
22、性产物易于与错误折叠蛋白质分离折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性方法易于放大复性过程耗时较少,47,2023/6/26,包涵体复性常用方法,透析、稀释、超滤 高蛋白浓度下的复性方法添加促进剂的复性方法液相色谱法双水相复性法,48,2023/6/26,大肠杆菌表达体系的优势,技术成熟，基因克隆表达载体众多，受体细胞类型丰富繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达操作安全，致病能力低 成本相对低得多,49,2023/6/26,缺点：缺乏适当的转录后和翻译后加工机制缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解原核生物载体构建的重组体是无法进
23、入动物细胞进行表达热源、内毒素不易除去 常会形成包涵体,50,2023/6/26,外源基因在真核细胞中表达,真核表达系统主要有：酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物表达系统优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即产物翻译后糖基化，羟基化，羧基化等修饰，有加强蛋白的稳定和功能活性；通常不形成包涵体，能正确折叠缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量低,51,2023/6/26,酵母表达系统概述 1.大肠杆菌表达系统缺陷缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性,2023/6/26,52,酵母重组表达,大
24、肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌，但不能表达结构复杂的蛋白质哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白，但操作复杂，表达水平低酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化酵母表达系统在表达真核细胞外源蛋白时，既具有原核生物生长快、操作简便的特点，又具备哺乳类细胞翻译后加工和修饰的功能，从而表达有一定生物活性的外源蛋白,53,2023/6/26,酵母载体类型 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNAYep类（Yeast episomal plasmid）附加体型Yrp类（Yeast replication plasmid）复制型Yc
25、p类（yeast centromeric plasmid）：复制序列为ARS，并含有酵母染色体中心粒、端粒成分，稳定性好，但拷贝数只有一个，转化频率103-104/g DNAYip类（yeast integrative plasmid）整合型:含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中。因此它依靠酵母染色体进行复制，具有很好的稳定性。拷贝数只一个，转化频率1-100/g DNA,2023/6/26,54,酵母表达载体的分类,酵母载体由酵母2u质粒构建而来,2023/6/26,55,酵母表达载体的结构特点,酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒，包括来自酵母的部分基因序列和细菌的部
26、分基因序列其细菌部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的复制起点序列（ori）和特定的抗生素抗性基因序列。能在大肠杆菌中克隆、且具有较高的拷贝数，这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增和筛选其酵母部分包括与宿主互补的营养缺陷型基因序列或特定的抗生素抗性基因序列、编码特定蛋白基因的启动子和终止子序列,56,2023/6/26,外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝-高表达外源基因表达效率：启动子外源蛋白糖基化：酵母分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同宿主菌珠影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强,影响酵母重组表达的因素,57,2023/6/26,酿酒酵母的优缺点
27、,优点：生长繁殖速度快，易培养，能高密度发酵，成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不稳定，表达质粒易于丢失等,58,2023/6/26,甲醇酵母表达系统,1.甲醇酵母的生物学特征：甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源甲醇代谢第一步：甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白质的表达在甲醇酵母中有两种乙醇氧化酶基因：AOX1和AOX2,59,2023/6/26,AOX1：细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由AOX1提供。当细胞以甲醇为唯一碳源时，AOX1基因的表达被甲醇严格调控，并被诱导到很高的水平，此
28、时细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这种菌株称为MutAOX2：当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，在甲醇培养基上生长缓慢，这种菌株称为MutS,60,2023/6/26,61,2023/6/26,2.表达载体和受体菌,用于表达的甲醇酵母受体菌：GS115、KM71、SMD1168 均为组氨酸缺陷型：在没有组氨酸的培养基上细菌不能生长。如表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氨酸缺陷，因此可在不含组氨酸的培养基上筛选转化子,62,2023/6/26,甲醇酵母表达载体的特点,5AOX1：含AOX1启动子，可调控异源蛋白表达，同时也是
29、载体和受体菌染色体发生重组的位点MCS：多克隆位点，允许目的基因插入TT：转录终止和多聚腺苷酸化序列，允许mRNA有效转录终止和多聚腺苷酸化3AOX1：TT序列下游区域，同源重组位点之一His4：编码组氨酸，提供转化子筛选标记，也是重组位点之一Ampr：氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选,63,2023/6/26,甲醇酵母的转化与目的基因整合,大肠杆菌表达载体：有复制子，可自行复制 甲醇酵母表达载体：不含酵母复制起点 同源重组：导入酵母体内的重组表达载体和酵母染色体上的同源区发生重组，从而整合到染色体上（两条DNA分子相互交换对等部分），使目的基因稳定存在，目的基因稳定表达，形成转化子 重组的
30、区域：5AOX1、3AOX1和His位点为整合区 重组的方式：单交换：即插入，目的基因通过重组插入到酵母染色体上，AOX1基因仍然保留，转化子表型为Mut+双交换：即替换，目的基因通过重组替换了染色体上的AOX1基因，造成AOX1缺失，转化子表型为Muts 甲醇酵母转化方法：原生质法、电转法、PEG法、LiCl法,64,2023/6/26,甲醇酵母表达系统的优点,具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启动子，可严格调控目的蛋白的表达作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产可高密度发酵培养表达量高表达蛋白
31、可存于胞内，也可分泌到胞外（有利于纯化）糖基化程度低,65,2023/6/26,第四节 昆虫表达系统,特点：外源基因表达产量高（1-500mg/L）；昆虫细胞培养条件简单；昆虫病毒宿主范围窄，不感染脊锥动物细胞，具较高的安全性转化方式：同源重组：磷酸钙共沉淀法启动子：多角体蛋白启动子：非常强，其控制的外源蛋白的表达可达到细胞蛋白的30P10蛋白启动子已有系统：Clontech公司的BacPAKTM杆状病毒表达系统，IPLB-Sf21 Cells，提供两个转移质粒：pBacPAK8和pBacPAK9,2023/6/26,66,昆虫表达载体,杆状病毒和Bacmid载体：pIEx昆虫表达载体(Nov
32、agen)Bac-N-BlueBaculovirus 表达体系(Invitrogen),2023/6/26,67,昆虫杆状病毒（Baculovirus）如核型多角体病毒ACNPV，昆虫体系的优点是表达效率高，目的基因插入的容量相对大，使用安全等,68,2023/6/26,BaculoDirect杆状病毒表达系统是生产重组杆状病毒最快和最容易的方法 不需要烦琐的细菌转化和bacmid的分离，或是将转移载体和线性杆状病毒DNA共转染进昆虫细胞经过生物工程改造的BaculoDirect线性DNA（杆状病毒基组），利用快速和有效的Gateway重组反应代替了这些烦琐的工作 使用BaculoDirect
33、系统，从最初的反应混合物的转染到杆状病毒苗的分离，只需要花费大约8小时仅花费了不到传统方法一半的时间！BaculoDirect系统:BaculoDirect线性DNA包含了attR位点，允许与包含有目的基因进行有效的重组 将entry克隆、BaculoDirect线性DNA 和LRClonase酶混合物稍加混匀，在室温下反应1小时即可 最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（sf9或sf21）,69,2023/6/26,已发展和使用的病毒载体有：SV40病毒载体，腺病毒载体，多瘤病毒载体，牛痘痘苗宾服度载体，单纯泡疹病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒相关病毒载体
34、，EB病毒载体，牛乳头瘤病毒载体等,哺乳动物细胞的表达载体,第五节 动物细胞表达体系,70,2023/6/26,影响外源基因在哺乳动物表达的序列因素,启动子：起始位点上游20bp处的TATA盒RAN聚合酶开始装配和转录的地方;CAAT盒;GC盒增强子：增强子序列是决定基因表达强度基因表达空间与时序的重要元件;SV40增强子;人巨细胞病毒（CMV）增强子;逆转录病毒LTR增强子RNA剪接位点和内含子：内含子一般含有决定基因表达强度和时空专一性的构件，一些启动子可和内含子相互作用提高表达水平;5非翻译区序列（5UTR）：5UTR的长度至少大于20bp起始AUG及其周围序列：3非翻译区（3UTR）：
35、,2023/6/26,71,真核表达系统的研究中最受重视的是哺乳动物细胞表达系统-动物病毒衍生载体每一种动物都有多种特异性的病毒，单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒和双链RNA病毒 与动物受体细胞相适应的载体一般是动物的病毒DNA，可用于外源基因向真核细胞的转入因病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达元件不少来自病毒。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等它们象噬菌体一样，需要体外包装成有活性的病毒颗粒，然后以生物学方式高效感染受体细胞,动物细胞表达载体,2023/6/26,72,作为基因转移载体的常用动物病毒,猴空泡病毒（Simian virus40 简称SV
36、40）腺病毒（Adenovirus）乳头状病毒（Papilloma virus）逆转录病毒（Retrovirus）牛痘（Vaccinia）病毒牛疣病毒（Bovine papilloma virus）,2023/6/26,73,动物表达载体所具条件,具动物病毒复制起始点，以便表达载体能有效的转染动物细胞，使能在细胞内复制，增加外源基因拷贝数具可供选择的标志基因，因为重组病毒载体转染力很低，一般仅为105107，只有利用标志基因才能筛选出有表达载体的转化克隆细胞株具外源基因表达所必需的全部顺式结构（大多来自动物病毒），包括启动子、增强子、内含子剪切位点，转录终止子、多聚腺苷酸信号等启动子下游有适当
37、的多种单一内切酶位点，可插入外源基因还需具细菌质粒复制起始点和抗性基因，以便能够在细菌中扩增和选择,2023/6/26,74,真核细胞的转录终止终止机制是转录越过修饰点后，在修饰点处切断，随即加入polyA基因工程中最常使用的加尾信号序列来自于SV40病毒,终止信号和加尾信号,2023/6/26,75,SV40作为基因表达载体的优点,DNA分子量小，感染率高由于DNA大量复制，重组DNA在细胞内的拷贝数也随之增加，转录产物可达到相当高的水平SV40能提供一套完整的真核基因表达成分，包括启动子、DNA剪接信号、转录终止位点和多聚腺苷酸化位点，故只要把外源DNA插入SV40启动子和剪接信号之间，外
38、源基因就能表达,76,2023/6/26,导入基因的方法,病毒载体,化学法,物理法,其他方法,逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、泡疹病毒、腺病毒相关病毒,磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法,显微射，电转移法、基因枪,精子载体法、胚胎干细胞（ES）介导法、染色体片段注入法、血影细胞介导法,77,2023/6/26,能进行复杂的蛋白翻译后加工修饰外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式,表达方式,特点,78,2023/6/26,筛选标记基因（详见第十章第四、第五节）,是细胞产生特定的药物抗性或产生荧光常用的筛选标记有：常用的抗性基因：新霉素抗性基因（neor）,氨基糖苷转移酶
39、,此 基因对氨基糖苷抗生素G418有抗药性 潮霉素抗性基因:潮霉素B磷酸转移酶（hyg）氨甲蝶呤抗性基因:氨基蝶呤抗性基因:二氢叶酸还原酶（dhfr）霉酚酸抗性基因,基因表达产物的检测,基因转录水平的检测：Northern Blot，RNA杂交保护，RT-PCR蛋白翻译水平的检测：ELISA、Western Blot，高压液相，质谱等生物活性的检测,2023/6/26,79,80,2023/6/26,第六节 转基因表达,转基因动物转基因植物转基因技术,81,2023/6/26,基因修饰（Genetic Modification,GM）,基因修饰是创造转基因生物体的过程将人工分离和修饰过的基因导
40、入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically Modified Organism，GMO）,第六节 转基因表达,82,2023/6/26,基因修饰的核心,在分子水平上，物种间遗传材料的转移(例如，将的鱼的基因插入番茄体内)。这种转基因变化获得的生物体性状是通过自然方法所达不到的。转基因生物体将被用来表示任何含有重组DNA的生物体这就是说，它有从其他生物体转移过来的DNA,第六节 转基因表达,83,2023/6/26,I.转基因动物,转基因动物：通过人工的实验方法
41、，把所需要的人或哺乳动物某种基因分离出来后再转移到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，与受精卵染色体DNA整合在一起，当细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，每个细胞中都带有该目的基因，使性状得以表达，稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。严格意义上说，转基因动物是人工创造的新动物转基因动物：指人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内，通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状稳定传递给后代的一类动物凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物（Transgenic Animal）,第六节 转基因表达,84,2023/6/26,自1974年Jaenish等利用显微
42、注射法（Microinjection）将SV40 DNA注射到小鼠胚胎的囊胚腔中获得了含SV40 DNA的转基因小鼠以来，转基因动物的研究已得到了快速发展1981年Gordon和Ruddle用显微注射法把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生78只小鼠，其中有2只所有细胞中(包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠（Transgenic Mice），自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物Palmiter等（1982）将大鼠生长激素基因转移到小鼠受精卵中，获得人类历史上第一个转基因动物转基因“超级鼠
43、”，生长速度快、体型比一般小白鼠大一倍,简史,第六节 转基因表达,85,2023/6/26,1983年，世界上第一例转基因植物（一种含有抗生素药类抗体的烟草）在美国成功培植Hammer等（1985）获得了转基因兔、羊和猪等朱作言等（1985）获得了转基因鱼Biery等（1988）通过转基因技术获得了转基因Wilomut等（1997）通过体细胞核移植的方法制备了克隆羊Dolly1994年，孟山都(Monsanto)公司下属Calgene公司研制的延熟保鲜转基因番茄是第一个转基因食品,第六节 转基因表达,86,2023/6/26,理论研究动物改良：使肉质改善、饲料增效、个体增大、体重增加、奶量提高
44、、脂肪减少、增强动物抗病力等生物制药：将药物蛋白基因转入羊、牛体内，使乳汁中含有“药”，利用转基因动物生产蛋白质、造药，将是全新的药物生产模式药物筛选及器官移植：还将是人类最好的“器官库”，提供从皮肤、角膜，到心、肝、肾等几乎所有的“零件”,转基因动物的应用,第六节 转基因表达,87,2023/6/26,理论研究,第六节 转基因表达,88,2023/6/26,其中转基因小鼠研究,基因表达与调节基因胚胎发育人类疾病的动物模型基因治疗药物的检验特殊细胞类型细胞系的建立组织特异性诱导基因的表达组织特异性基因删除毒性基因特异性细胞消除自身免疫耐受机制,第六节 转基因表达,89,2023/6/26,动物
45、改良,利用转基因动物技术提高动物的繁育速度。1982年Palmiter等将大鼠的生长激素基因导入小鼠的基因组中，转基因小鼠长成巨型小鼠。随后不同来源的生长激素基因被导入小鼠中，研究表明，外源生长激素基因的表达可大大促进转基因动物的生长速度利用转基因动物技术改善动物品质。改善乳品的营养成分和生理生化特征是改良牛、羊等动物品种的重要方面。牛奶中含有大量的乳糖，而多数人不能完全消化乳糖或对乳糖过敏，不被消化的乳糖在小肠内被细菌分解为短链脂肪酸、水和CO2等，严重时会导致人发生腹泻、恶心或脱水等。Bernard等用乳糖特异性表达启动子与大鼠肠乳糖酶基因cDNA连接构建表达载体导入小鼠基因组中，获得的转
46、基因小鼠分泌的乳汁中乳糖的含量减少了50%85%利用转基因动物培育抗病害动物品系。将干扰素基因、反义核酸基因、核酶基因和病毒单克隆抗体基因等导入畜禽等动物基因组中，使其获得特异性抗病毒或抗疾病能力。,第六节 转基因表达,90,2023/6/26,生物制药,传统的基因工程产品是通过微生物发酵而获得的，其主要缺陷是表达蛋白不能正确折叠而丧失生物学活性，并且生产成本昂贵利用哺乳动物细胞系表达外源蛋白则细胞培养困难，表达量低，同样生产成本昂贵。利用转基因动物作为生物反应器生产人类蛋白质药物，其质量大大优于通过微生物发酵获得的产品，并且生产成本可以大大降低转基因动物生物反应器主要包括动物乳腺生物反应器和
47、动物血液生物反应器等,第六节 转基因表达,91,2023/6/26,哺乳动物乳腺生物反应器:将药用蛋白基因连接到乳腺蛋白质基因调节元件下游，使转基因化哺乳动物通过乳汁分泌表达蛋白优点：可使药物蛋白基因限于乳腺中高表达，能进行大量生产；表达蛋白质随乳汁及时排出体外，能促进药物蛋白基因的高水平表达；乳腺组织细胞具有蛋白质修饰功能，表达产物具有较高的生物学活性；蛋白质提取纯化的工艺简单。牛乳腺生物反应器中表达出抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、乳缺蛋白、胶原蛋白、生育激素、糖基转移酶、蛋白C等；在山羊乳腺生物反应器中表达抗凝血酶原、血清白蛋白、抗胰蛋白酶、生育激素、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗
48、体等哺乳动物血液生物反应器:可用来生产人血红蛋白、抗体和非生物学活性状态的融合蛋白，对于有活性的蛋白质或多肽则不适合，因它会通过血液循环进入组织细胞而影响转基因动物的健康。DNX公司（1988）通过转基因猪表达人血红蛋白;Behringer等（1989）将小鼠成功表达了人、球蛋白;Swanson等（1992）用转基因猪生产人血红蛋白二聚体;Shama等（1994）用猪球蛋白基因启动子在转基因猪中高效表达了人的血红蛋白，产量高达24%,第六节 转基因表达,92,2023/6/26,药物筛选及器官移植,建立敏感动物品系和产生与人类相同疾病的动物模型来进行药物筛选，可大大提高药物筛选的准确性、缩短试
49、验时间、减少试验次数、降低筛选成本。由于新药筛选方法和模型的建立是新药研究和开发的关键环节，传统的筛选方法是进行动物实验和体内实验，而传统的动物模型一般选取与人类某种疾病有类似症状的动物，其致病的机理常与人体不完全一致，因而导致筛选结果与临床结果不一致。目前转基因动物已用于抗肿瘤、抗爱滋病、抗肝病等药物筛选异种器官移植:猪器官的大小和解剖生理特点与人类相似，组织相容性抗原SLA与人HLA具有较高的同源性，而且携带人畜共患疾病的病原体相对较少，容易饲养，生产成本低廉，因此极有可能用于替代人类的某些病变器官,第六节 转基因表达,93,2023/6/26,转基因植物,通过基因工程方法，把作物基因构成
50、加以改变，培育出的新品种1983年，世界上第一例转基因植物含抗生素药类抗体烟草在美国成功培植。当时就曾有人惊叹：“人类开始有了一双创造新生物的上帝之手”目前全球已拥有120多种转基因植物，其中转基因大豆（抗除草剂）、棉花（抗虫、抗除草剂）、玉米（抗虫、抗除草剂）、油菜（抗虫、抗除草剂、高含量月桂酸種子）、西红柿（抗干旱、早熟、保鲜防腐）等51种已开始商品化生产在所有转基因作物中，转基因大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积占99%以上。全球种得最多的转基因作物是大豆，占全球大豆总种植面积的62%，其次是玉米（21%）和棉花（12%）类型：转基因作物涉及的遗传改良性状主要包括：抗除草剂基因占总面积的7
